張桂芳 王 穎 郭希娟 張東杰

(國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319)

國外近年有不少有關(guān)瓦松黃酮粗提取物生物活性的報(bào)道〔1～3〕?，F(xiàn)有研究表明，瓦松屬植物中含有大量草酸以及黃酮類、多糖類、有機(jī)酸類、三萜、甾醇類等多種活性成分〔4～6〕。中國作為瓦松資源最豐富的國家之一〔7〕，開發(fā)利用瓦松的黃酮類活性物質(zhì)和藥用功效非常有價(jià)值。本文擬以四氧嘧啶誘發(fā)的糖尿病大鼠為模型，探討瓦松黃酮粗提物對糖尿病大鼠血脂和臟器的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 SD雄性大鼠，等級為無特定病原體級(SPF)，鼠齡5 w，體重(150±10)g，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院試驗(yàn)動物中心。

1.2實(shí)驗(yàn)材料及試劑 瓦松全草：購自本地藥店；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：上海滬宇生物試劑公司；四氧嘧啶(Alloxan，ALX)：上海億欣生物科技有限公司；硝酸鋁、亞硝酸鈉、乙醚、甲醇、氯仿等均為國產(chǎn)分析純。

1.3儀器與設(shè)備 T6系列紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；DGG-9053A型鼓風(fēng)干燥箱(上海森信試驗(yàn)儀器有限公司)；RE5298型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；怡成血糖測試儀及測定試紙(北京怡成生物電子技術(shù)有限公司)；LGR20-W型臺式高速冷凍離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司)；M149928型全自動干式生化分析儀(日本富士)動物專用(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1瓦松黃酮粗提物制備方法 在前期提取研究的基礎(chǔ)上，采用熱水回流浸提的方法制備瓦松黃酮粗提物(具體工藝另文發(fā)表)，得到的瓦松黃酮提取液在60℃下蒸發(fā)濃縮至膏狀物，浸膏得率約為27.6%。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，通過NaNO2-Al(NO3)比色法〔8〕測定的總黃酮含量為834.8 mg/100 g。試驗(yàn)樣品在-20℃下保存?zhèn)溆?，使用前稀釋成需要的濃度?/p>

1.4.2造模方法 試驗(yàn)大鼠馴養(yǎng)1 w后，在糖尿病誘發(fā)前禁食不禁水14～16 h；誘發(fā)當(dāng)日，60只大鼠均通過腹腔注射ALX來誘發(fā)糖尿病，初次注射量為80 mg/kg體重，次日追加注射量為60 mg/kg體重；注射72 h后進(jìn)行尾部靜脈采血測定空腹血糖值，血糖值≥11.1 mmol/L的大鼠被認(rèn)定糖尿病誘發(fā)成功〔9〕。

1.4.3分組與給藥方法 大鼠糖尿病誘發(fā)成功后隨機(jī)選取40只糖尿病大鼠和10只正常大鼠進(jìn)行試驗(yàn)，分成5組，分別為正常組，模型組，低劑量組，中劑量組和高劑量組。給藥方法為灌胃給藥(ig)，每日1次，連續(xù)給藥28 d；試驗(yàn)動物分組和藥劑分配方法為：正常組0.9%生理鹽水；模型組0.9%生理鹽水；低劑量組20 mg/kg瓦松黃酮粗提物；中劑量組40 mg/kg瓦松黃酮粗提物；高劑量組80 mg/kg瓦松黃酮粗提物，劑量均為20 ml/kg。

1.5實(shí)試驗(yàn)動物樣本的采集方法

1.5.1血液樣本的采集 灌胃實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有實(shí)驗(yàn)大鼠禁食14～16 h后在放松的狀態(tài)下用過量的乙醚致昏，確定昏迷后將大鼠四肢固定在解剖臺上，頭部用裝有乙醚棉球的容器扣住，血液樣品來自心臟動脈血，打開胸腔后用無菌注射器刺入右心室，緩慢抽取15 ml左右的血液樣本后迅速放入冰浴中靜置冷卻15～20 min，然后在溫度4℃速度3 000 r/min的條件下離心15 min，吸取上層血清于封閉試管內(nèi)在-70℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2臟器樣本的采集 血液樣本采集后，迅速從大鼠體內(nèi)采取肝臟、脾臟和胸腺樣本，編號后清除掉臟器周圍結(jié)締組織，再用消毒后的生理鹽水進(jìn)行洗凈，放在濾紙上吸除多余水分后稱重并記錄，然后迅速放入冰浴中。編號后進(jìn)行分類存放，所有樣本均在-70℃溫度下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3血液脂質(zhì)指標(biāo)的測定方法 心臟動脈血經(jīng)離心分離得到的血清通過生化分析儀進(jìn)行檢測，檢測項(xiàng)目包括：①血清谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(GOT)酶活性;②血清谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)酶活性;③血清總膽固醇(TC)濃度;④血清甘油三酯(TG)濃度；⑤血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)濃度；⑥血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)濃度，通過Friedewald’s公式計(jì)算得到：LDL-C=TC-HDL-C-TG/5〔10〕；⑦動脈粥樣硬化指數(shù)(AI)，通過公式計(jì)算得到：AI=(TC-HDL-C)/ HDL-C〔11〕。

1.5.4臟器指數(shù)的測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前稱取大鼠體重計(jì)算臟器系數(shù)，臟器指數(shù)=某個(gè)臟器的濕重與單位體重的比值，通常是每100 g體重中某臟器所占的重量。

2 結(jié) 果

2.1瓦松黃酮粗提物對試驗(yàn)大鼠血液脂質(zhì)指標(biāo)的影響 與正常組相比，模型組大鼠血清TC(P<0.05)、TG、LDL-C含量(P<0.01)和AI值(P<0.01)升高，而血清HDL-C含量明顯降低；與模型組大鼠相比，經(jīng)過28 d的灌胃實(shí)驗(yàn)，瓦松黃酮試驗(yàn)組大鼠的血清TC含量、TG含量、LDL-C含量和AI值均有所下降，而血清HDL-C含量有所升高；其中高劑量組大鼠的血清TC含量(P<0.05)，中、高劑量組大鼠的血清LDL-C(P<0.01)含量和AI值(P<0.01)不僅顯著優(yōu)于模型對照組，同時(shí)與正常組大鼠接近。見表1。

2.2瓦松黃酮粗提物對糖尿病大鼠血清GOT和GPT酶活性的影響 與正常組相比，模型組大鼠血清GOT(P<0.05)和GPT(P<0.01)的酶活性顯著增加；與模型組大鼠相比，經(jīng)過28 d的灌胃實(shí)驗(yàn)，瓦松黃酮試驗(yàn)組大鼠血清GOT和GPT酶活性(P<0.05)均有所降低，見表2。

表1 對試驗(yàn)大鼠的血清脂質(zhì)指標(biāo)水平的影響±s，n=10)

表2 對試驗(yàn)大鼠血清GOT和GPT活性的影響±s，n=10，U/L)

2.3瓦松黃酮粗提物對糖尿病大鼠臟器系數(shù)的影響 與正常組相比，模型組大鼠肝臟指數(shù)(P<0.05)、脾臟指數(shù)(P<0.01)和胸腺指數(shù)(P<0.05)明顯降低；與模型組大鼠相比，經(jīng)過28 d的灌胃實(shí)驗(yàn)，瓦松黃酮試驗(yàn)組肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均有所升高。其中瓦松黃酮中、高劑量組大鼠脾臟指數(shù)與模型組差異顯著(P<0.01)。見表3。

表3 對試驗(yàn)大鼠肝臟、脾臟和胸腺指數(shù)的影響±s，n=10，g/100 g)

3 討 論

正常狀態(tài)下，脂代謝在肝臟中保持著動態(tài)平衡。糖尿病發(fā)生后，由于胰島素的分泌不足，導(dǎo)致體內(nèi)糖代謝紊亂，糖異生明顯增加，組織蛋白及脂質(zhì)大量分解，肝臟攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì)的能力開始降低，導(dǎo)致血漿中的脂質(zhì)水平明顯增高，從而也導(dǎo)致了諸如高脂血癥、酮癥酸中毒、高脂蛋白血癥等糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生〔12～14〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示瓦松黃酮粗提物具有降低糖尿病大鼠血脂水平和動脈硬化風(fēng)險(xiǎn)的作用。

血清GOT和GPT的活性是衡量肝臟損傷情況的重要指標(biāo)〔15〕；本研究結(jié)果提示瓦松黃酮粗提物對糖尿病大鼠的肝損傷具有一定的修復(fù)作用。糖尿病是一種慢性代謝障礙性疾病，持續(xù)的高血糖會產(chǎn)生一系列的生理病理反應(yīng)，血中糖、脂、氨基酸濃度升高，結(jié)果會導(dǎo)致許多器官功能失調(diào)〔16～18〕。臟器指數(shù)是評價(jià)臟器生理功能的重要指標(biāo)，可以較為宏觀地反映臟器的生長狀況。本研究結(jié)果提示在糖尿病誘發(fā)后大鼠的臟器生長受損，導(dǎo)致大鼠臟器重量下降；通過28 d的灌胃瓦松黃酮粗提物，雖然肝臟指數(shù)和胸腺指數(shù)與模型對照組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異，但是瓦松黃酮粗提物各組大鼠的脾臟指數(shù)顯著升高；脾臟和胸腺是人體主要的免疫器官主要功能是參與免疫反應(yīng)，含有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心〔19〕，結(jié)果提示瓦松黃酮粗提物對增強(qiáng)機(jī)體免疫力具有一定的作用。

本研究結(jié)果提示瓦松黃酮粗提物能夠治療糖尿病所引起的高脂血癥，對糖尿病型肝功能損傷和其他臟器的損傷有一定修復(fù)作用。對于瓦松黃酮粗提物的純化和鑒定，以及進(jìn)一步的藥理作用和安全性有待進(jìn)一步深入研究。

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