楊 震 李 波 周焯家 簡月奎 趙偉峰 田曉濱

(貴州省人民醫(yī)院骨科，貴州 貴陽 550002)

脂肪間充質(zhì)干細胞(ADSCs)是一種具有自我更新和多向分化潛能的多能干細胞〔1〕,是組織工程中常用的一種成體干細胞，在一定條件下可以分化成脂肪細胞、成骨細胞、骨細胞、肌細胞、神經(jīng)細胞等〔2～4〕。ADSCs與骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)有相似的生物學(xué)特性，同時具有來源豐富、取材容易、對機體損傷小、體外增殖迅速和生物學(xué)性狀穩(wěn)定等優(yōu)點〔5〕，是理想的組織工程和再生治療的種子細胞，具有不可多得的優(yōu)勢和前景〔6〕。在體外試驗中，可通過多種方式進行ADSCs成軟骨的誘導(dǎo)，ADSCs 在軟骨修復(fù)領(lǐng)域的巨大潛能〔7〕。本文成功分離和培養(yǎng)人(hADSCs)，并通過細胞載體復(fù)合物成功誘導(dǎo)hADSCs成軟骨細胞分化。

1 材料和方法

1.1材料和試劑 脂肪組織來自貴州省人民醫(yī)院手術(shù)提供，捐贈者無重大疾病史，經(jīng)捐贈者同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過。Ⅰ型膠原酶購于美國Sigma公司；DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購于美國Gibco公司；鼠抗人CD29-PE、CD34-PE 、CD45-FITC購于美國BD公司，CD90-異氰硫酸熒光束(FITC)、CD105-FITC購于美國Sigma公司；兔抗骨唾液酸蛋白(BSP)、骨橋蛋白(OPN)、骨連接蛋白(ON)多克隆抗體、鼠抗人Collagen Ⅱ購于英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1hADSCs分離和培養(yǎng) 原代hADSCs分離：無菌條件收集脂肪組織， 磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3遍，剔除肉眼可見的血管及結(jié)締組織，組織盡量剪碎至約1 mm3顆粒。加入2倍體積的1 mg/mlⅠ型膠原酶消化液(Sigma，美國)，置于搖床上，37℃消化30 min后加入等體積DMEM培養(yǎng)基終止消化。靜置5 min后吸去上層成熟脂肪細胞， 1 200 r/ min離心5 min，留取下層片狀沉淀，用DMEM重懸后200 目篩網(wǎng)過濾。將細胞以3×104個/cm2密度接種至培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后用PBS緩沖液沖洗，除去未貼壁的細胞和細胞碎片。2～3 d更換1次完全培養(yǎng)基(含10%FBS)。待細胞生長至90%融合時進行常規(guī)細胞傳代培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細胞生長情況。

1.2.2hADSCs細胞表面分子標(biāo)志檢測 第3代hADSCs用0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化并收集細胞，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1 × 106個/ml，分別與鼠抗人CD29-PE、CD34-PE、CD45-FITC、CD90-FITC、CD105-FITC4 ℃避光孵育30 min，PBS清洗2次后重懸，進行流式細胞儀檢測。并使用同型對照單克隆抗體確定背景標(biāo)記。

1.2.3hADSCs生長曲線測定 第3代對數(shù)期hADSCs，常規(guī)消化并收集細胞，按1 × 104個/孔密度接種于96孔板中。分別于第2～8天每隔24 h用噻唑藍(MTT)法、酶標(biāo)儀上測定450 nm處吸光度值。每組3個復(fù)孔，同時設(shè)置調(diào)零孔。

1.2.4hADSCs多分化潛能測定檢測 第3代hADSCs生長至90%融合時，用0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化并收集細胞，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1 × 105個/孔密度接種于鋪有蓋玻片的6孔板中。當(dāng)細胞生長至60%融合時進行誘導(dǎo)分化。

1.2.4.1hADSCs成脂誘導(dǎo)分化與檢測 將培養(yǎng)基更換為成脂培養(yǎng)基，成脂培養(yǎng)基成分：10%FBS、0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、0.5 μmol/L地塞米松、10 μmol/L胰島素、50 μmol/ L吲哚美辛；每2～3天換液。以未加誘導(dǎo)培養(yǎng)基(僅用完全培養(yǎng)基)的細胞培養(yǎng)孔作為空白對照。誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后將蓋玻片上的細胞進行油紅O染色鑒定。

1.2.4.2hADSCs成骨誘導(dǎo)分化 將培養(yǎng)基更換為成骨培養(yǎng)基，成骨培養(yǎng)基成分：10%FBS、10 mmol/L β甘油磷酸、100 nmol/L地塞米松、50 μmol/L抗壞血酸。以未加誘導(dǎo)培養(yǎng)基(僅用完全培養(yǎng)基)的細胞培養(yǎng)孔作為空白對照，誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d。通過免疫熒光檢測BSP、OPN、ON的表達。

1.2.4.3hADSCs成軟骨誘導(dǎo)分化 將培養(yǎng)基更換為成骨培養(yǎng)基，成軟骨培養(yǎng)基成分：10%FBS、2 mg/L 胰島素、3 mg/L 轉(zhuǎn)鐵蛋白、1 mmol/L 丙酮酸、100 nmol/L 地塞米松、10 μg/L 轉(zhuǎn)化生長因子 β。將蓋玻片上的細胞進行甲苯胺藍染色以及免疫組化檢測Ⅱ型膠原蛋白表達。

1.2.5hADSCs細胞載體復(fù)合物誘導(dǎo)培養(yǎng) 第3代hADSCs制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1 × 106個/ml。按細胞懸液∶FBS∶5倍濃縮DMEN∶膠原纖維蛋白溶液=2∶1∶2∶5(體積比)快速混勻形成hADSCs-膠原混懸液，立即加入12孔板，2ml/孔，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min后形成凝膠狀，加入完全培養(yǎng)基1 ml進行培養(yǎng)。根據(jù)膠原纖維蛋白溶液分為三組： A組：Ⅰ膠原纖維蛋白20%+Ⅱ膠原纖維蛋白60%+Ⅲ膠原纖維蛋白20%。；B組：Ⅱ膠原纖維蛋白；C組：Ⅰ膠原纖維蛋白。另一組無膠原溶液，進行常規(guī)培養(yǎng)作為對照組，即為D組。每組3個復(fù)孔。2～3 d換液一次，培養(yǎng)14 d后將凝膠固定、包埋，切片后進行甲苯胺藍染色以及免疫組化檢測Ⅱ型膠原蛋白表達。

2 結(jié) 果

2.1hADSCs的形態(tài)學(xué)特點 原代細胞24 h后開始貼壁，2 d后細胞貼壁伸展生長，呈短梭型或是不規(guī)則三角形、四邊形或多邊形，見圖1A。3 d 后觀察可以看到細胞漸漸呈現(xiàn)梭型或長梭型，培養(yǎng)5～7 d后細胞開始增殖。傳代培養(yǎng)后4～6 h貼壁，細胞融合時呈漩渦狀或放射狀生長排列，細胞形態(tài)較均一，呈纖維細胞樣生長。見圖1B。

A.原代hADSCs 2 d B.第三代hADSCs 融合

2.2hADSCs生長曲線 細胞傳代后，增殖曲線呈S形，經(jīng)過2～3 d的潛伏期，5～6 d進入指數(shù)生長期，7 d后出現(xiàn)平臺期，此時細胞己達到近90%的融合。見圖2。

圖2 脂肪干細胞增殖曲線

2.3hADSCs細胞表面抗原標(biāo)志分析 流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，第3代hADSCs CD29、CD90、CD105呈陽性表達；而CD34、CD45呈陰性表達。

2.4hADSCs多分化潛能測定 hADSCs成脂誘導(dǎo)后光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)由長梭形變成類圓形，在細胞質(zhì)內(nèi)有透亮的脂滴出現(xiàn)(圖3B)，隨著誘導(dǎo)時間延長而逐漸增多，14 d 結(jié)束誘導(dǎo)時油紅O染色脂滴呈鮮紅色(圖3C)，未經(jīng)誘導(dǎo)的細胞無明顯變化(圖3A)。hADSCs成骨誘導(dǎo)后部分細胞胞體增大，梭形轉(zhuǎn)化為不規(guī)則多角形或立方形，免疫熒光檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞不同程度表達BSP、OPN、ON，見圖4。hADSCs成軟骨誘導(dǎo)后，鏡下可見細胞形態(tài)變?yōu)殇伮肥瘶樱妆桨匪{染色，細胞周圍有藍色基質(zhì)染色，經(jīng)Ⅱ型膠原免疫組化染色結(jié)果呈陽性。見圖5。

A.未經(jīng)誘導(dǎo) B.誘導(dǎo)后 C.誘導(dǎo)后油紅O染色

圖4 hADSCs成骨誘導(dǎo)分化(×200)

阿利新藍染色 免疫組化檢測Ⅱ型膠原蛋白

2.5細胞載體復(fù)合物的成軟骨誘導(dǎo)鑒定結(jié)果 A、B、C組細胞均有不同程度的阿利新藍染色。對照組無明顯染色。免疫組化檢測Ⅱ型膠原蛋白結(jié)果顯示，A組陽性表達()， B、C組弱陽性表達(+)，D組陰性表達。

3 討 論

急慢性軟骨組織損傷造成的關(guān)節(jié)炎在全世界有極高的發(fā)病率，尤其是在老年患者中有極高的發(fā)病率。因關(guān)節(jié)軟骨沒有血管、神經(jīng)及淋巴組織，自身修復(fù)能力非常有限，其治療一直是骨科領(lǐng)域的一個難題。目前利用組織工程技術(shù)進行軟骨修復(fù)是軟骨疾病治療的主要研究方向之一。其中種子細胞的來源及培養(yǎng)，細胞載體材料的研究開發(fā)以及組織培養(yǎng)中各種因子的調(diào)控作用是研究的重要內(nèi)容。近年來將BMSCs作為骨和軟骨組織工程種子細胞的研究很多〔8〕，而研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs憑借其特有的優(yōu)勢，可作為構(gòu)建骨與軟骨組織工程中的種子細胞〔9〕。

研究顯示ADSCs有各種分離純化方法〔2,10〕，但仍缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的分離、培養(yǎng)、純化、鑒定方法。本研究成功分離出易于體外培養(yǎng)、并能穩(wěn)定增殖的hADSCs，通過細胞活性檢測發(fā)現(xiàn)獲得細胞活性高，增殖速度快，為后續(xù)研究提供高了質(zhì)量的細胞。

目前尚未有ADSCs公認的特異標(biāo)志物，本研究通過流式細胞術(shù)檢測多種表面抗原，結(jié)果顯示hADSCs表達間充質(zhì)干細胞相對特異性分子如CD105、CD90〔11〕。CD29識別整合素亞單位的蛋白，廣泛存在于除了紅細胞外的各種組織及細胞中，本研究分離的細胞CD29陽性表達表明是基質(zhì)類細胞〔12〕。而不表達造血干細胞和內(nèi)皮細胞標(biāo)記CD34、白細胞標(biāo)記CD45，排出了血細胞和內(nèi)皮細胞污染的可能性〔13〕。以上聯(lián)合鑒定的結(jié)果表明，本實驗分離所得的細胞是hADSCs，且細胞純度較高。

hADSCs在成脂誘導(dǎo)的過程中細胞形態(tài)成類圓形，胞質(zhì)中脂滴的出現(xiàn)以及經(jīng)油紅O染色結(jié)果證明該細胞具有成脂分化的能力。在成骨誘導(dǎo)分化中，細胞不同程度表達BSP、OPN、ON間接證明hADSCs在一定的條件下可誘導(dǎo)分化為成骨細胞。hADSCs成軟骨誘導(dǎo)后，從細胞形態(tài)以及甲苯胺藍染色和Ⅱ型膠原免疫組化結(jié)果均提示該細胞有分化成軟骨細胞的能力。

通過與不同濃度的膠原纖維蛋白的結(jié)合，形成細胞hADSCs載體凝膠復(fù)合物，鑒定檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ⅰ膠原纖維蛋白20%+Ⅱ膠原纖維蛋白60%+Ⅲ膠原纖維蛋白20%的混合膠原纖維蛋白組hADSCs成軟骨細胞分化更明顯，其分化程度高于獨一種類的膠原纖維蛋白組。提醒人們，復(fù)合膠原蛋白可能具有一定成軟骨誘導(dǎo)作用。同時研究顯示膠原蛋白是作為軟骨支架材料，在組織工程軟骨研究中有重要地位。膠原蛋白作為載體，與細胞相容性好且具有較低的抗原性，承重性、可降解性等均較好〔14〕。于洪宇等〔8〕將來源于骨髓的間充質(zhì)細胞包埋在"殼聚糖-膠原蛋白"凝膠里，將移植物移植到骨軟骨缺損區(qū)承重兔關(guān)節(jié)表面，觀察到可以修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損。提示膠原蛋白作為支架材料，同時誘導(dǎo)hADSCs誘導(dǎo)成軟骨細胞分化，有可能作為修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的理想支架材料。

綜上所述，本研究成功分離出hADSCs，體外定向誘導(dǎo)細胞成脂、成骨和成軟骨分化，為組織缺損的再生修復(fù)提供了豐富的種子細胞。復(fù)合膠原纖維蛋白載體誘導(dǎo)細胞成軟骨細胞分化，為修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損支架材料的研究提供實驗依據(jù)。

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