黃 裕 姜青明 唐 郢 王 冬

宮頸癌的發(fā)生是多因素、多步驟的過程，多種因素和多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在其發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮作用，細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路具有重要調(diào)節(jié)作用，信號傳導(dǎo)異?？赡芤鸱只惓Ｉ踔翋夯?。DKK-1(Dickkopf-1)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β)、磷酸化的GSK-3β(PGSK-3β)均是參與Wnt腫瘤信號通路的重要成分，本研究采用免疫組織化學(xué)方法測定三者在不同宮頸組織中的表達(dá)，并結(jié)合臨床病理因素，分析它們在宮頸鱗癌發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

收集2010年1月至2013年5月間在我院門診活檢或手術(shù)治療的95例正?；虿∽儗m頸組織標(biāo)本，所有患者術(shù)前均未接受放化療。其中慢性宮頸炎25例，宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)29例，宮頸鱗癌41例，年齡29～72歲，平均(45.5±6.7)歲。同時記錄宮頸鱗癌患者臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織分化等臨床病理資料。

1.2 試劑和儀器

濃縮型兔抗人DKK-1多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，兔抗人GSK-3β多克隆抗體和兔抗人PGSK-3β多克隆抗體(美國Cell Signaling公司)，濃縮型DAB顯色試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)，SABC免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，光學(xué)顯微鏡和Olympus DP70圖像采集系統(tǒng)(日本Olympus公司)。

1.3 實驗方法

取宮頸組織的石蠟包埋標(biāo)本，制成4 μm厚度連續(xù)切片，采用免疫組織化學(xué)染色檢測其中DKK-1、GSK-3β、PGSK-3β的表達(dá)。高壓鍋法修復(fù)抗原，加入適當(dāng)稀釋的一抗(DKK-1稀釋度為1∶100，GSK-3β和PGSK-3β稀釋度為1∶50)，滴加試劑SABC室溫孵育30 min，使用DAB試劑盒進(jìn)行顯色。

1.4 結(jié)果判定

依據(jù)染色細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行綜合評分。在高倍光鏡下(×200)挑選5個視野，每個視野計數(shù)200個細(xì)胞。陽性標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)著色。染色細(xì)胞比例的積分標(biāo)準(zhǔn)為：陽性細(xì)胞數(shù)<10%為0分，10%～19%為1分，20%～50%為2分，>50%為3分。染色強(qiáng)度積分標(biāo)準(zhǔn)為：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將染色細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度兩項積分相乘，總分為0～2分為陰性表達(dá)，3～9分為陽性表達(dá)。應(yīng)用Image-pro5.0圖像分析軟件計算陽性細(xì)胞平均光密度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DKK-1、GSK-3β、PGSK-3β在宮頸組織中的表達(dá)

DKK-1陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，慢性宮頸炎組織中其陽性表達(dá)率為84.0%，從癌前病變發(fā)展至癌，DKK-1陽性表達(dá)率逐漸降低。慢性宮頸炎、CIN Ⅰ、CIN Ⅱ～Ⅲ組織中DKK-1陽性表達(dá)率均明顯高于宮頸癌(P均<0.05)。GSK-3β陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核中，慢性宮頸炎組織中GSK-3β陽性表達(dá)率明顯高于宮頸癌(P<0.05)。PGSK-3β陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，慢性宮頸炎組織中PGSK-3β陽性表達(dá)率明顯低于宮頸癌(P<0.05)，見表1。

表1 DKK-1、GSK-3β、PGSK-3β在各宮頸組織中的表達(dá)(例，%)

a為與宮頸癌比較，P<0.05。

2.2 各宮頸組織中GSK-3β和PGSK-3β陽性顆粒平均光密度

GSK-3β蛋白表達(dá)在宮頸癌組織中的表達(dá)量最高。PGSK-3β蛋白在CIN Ⅰ、CIN Ⅱ-Ⅲ及宮頸癌組織中的表達(dá)量明顯高于慢性宮頸炎，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CIN Ⅰ中PGSK-3β蛋白表達(dá)量最高，與宮頸癌組織比較差異顯著(P<0.05)，但隨著病情的發(fā)展逐漸呈下降趨勢，見表2。

表2 各宮頸組織中GSK-3β和PGSK-3β陽性顆粒平均光密度

注：a為與宮頸癌比較，P<0.05；b為與慢性宮頸炎比較，P<0.05。

2.3 DKK-1及PGSK-3β表達(dá)與宮頸鱗癌臨床病理特征的關(guān)系

DKK-1陽性表達(dá)率與宮頸鱗癌組織分化、FIGO臨床分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)；而與患者年齡、肌層浸潤程度無相關(guān)性(P>0.05)；PGSK-3β陽性表達(dá)率與宮頸鱗癌組織分化、FIGO臨床分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)；與患者年齡、肌層浸潤程度無相關(guān)性(P>0.05)，見表3。

表3 DKK-1、PGSK-3β表達(dá)與宮頸鱗癌臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

3 討論

DKK-1是1個分泌型糖蛋白，屬于DKK家族成員，是1種有力的Wnt信號途徑拮抗劑。DKK-1通過誘導(dǎo)形成1種三元復(fù)合物，產(chǎn)生內(nèi)吞作用，發(fā)揮抑制功能，造成Wnt經(jīng)典信號傳導(dǎo)途徑阻斷，從而誘導(dǎo)體內(nèi)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[1-3]。DKK-1在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，在宮頸癌細(xì)胞株Hela中DKK-1表達(dá)沉默，從Hela細(xì)胞株培養(yǎng)分離出的非致瘤性回復(fù)突變株中DKK-1高表達(dá)[4]。崔素芬等[5]對36例宮頸癌組織標(biāo)本進(jìn)行DKK-1陽性表達(dá)檢測，結(jié)果顯示DKK-1陽性表達(dá)呈現(xiàn)明顯下調(diào)。本研究中DKK-1在宮頸組織中陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，慢性宮頸炎、CIN Ⅰ、CIN Ⅱ～Ⅲ、DKK-1陽性表達(dá)率均明顯高于宮頸鱗癌中的陽性表達(dá)率(P<0.05)。從慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變發(fā)展至宮頸浸潤鱗癌，DKK-1的陽性表達(dá)率依次降低，提示DKK-1表達(dá)沉默在宮頸癌發(fā)生中存在重要作用，與文獻(xiàn)報道的研究結(jié)果相一致。研究DKK-1表達(dá)下調(diào)機(jī)制發(fā)現(xiàn)宮頸癌Hela細(xì)胞的致瘤性生長過程中需要關(guān)閉DKK-1基因，有異常甲基化出現(xiàn)于Hela細(xì)胞內(nèi)的DKK-1基因啟動子區(qū)，可能與組蛋白降解也存在相關(guān)性[6]。本研究還發(fā)現(xiàn)，DKK-1的陽性表達(dá)率在不同年齡、肌層浸潤分組間表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，在不同組織分化、臨床分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組間表達(dá)差異顯著(P<0.05)，提示DKK-1陽性表達(dá)高低可能有助于判定宮頸浸潤癌的預(yù)后。

GSK-3β作為1種多功能絲/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛參與細(xì)胞周期、細(xì)胞骨架的穩(wěn)定和基因表達(dá)等細(xì)胞基本功能的調(diào)節(jié)，PGSK-3β是磷酸化氮端9位絲氨酸后的GSK-3β失活形式，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥等密切相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，是一個重要腫瘤相關(guān)因子。GSK-3β在皮膚癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等上皮性腫瘤中均出現(xiàn)異常表達(dá)[7-8]，本研究顯示PGSK-3β的陽性表達(dá)率在不同組織分化、FIGO臨床分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組間表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示PGSK-3β表達(dá)可能是宮頸癌預(yù)后不良的獨立危險因素。另外研究還發(fā)現(xiàn)GSK-3β在宮頸組織中陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，從慢性宮頸炎、CIN發(fā)展為宮頸浸潤癌的過程中，GSK-3β陽性顆粒平均光密度呈逐漸下降趨勢，但在宮頸癌組織中表達(dá)最高。而PGSK-3β在宮頸組織中陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，在CIN Ⅰ、CIN Ⅱ～Ⅲ及宮頸鱗癌組織中的蛋白表達(dá)量明顯高于慢性宮頸炎(P<0.05)；PGSK-3β在CIN Ⅰ時的蛋白表達(dá)量最高，與宮頸癌比較差異顯著(P<0.05)，并隨著病程的發(fā)展逐漸呈下降趨勢。GSK-3β在慢性宮頸炎組織中保持較高的表達(dá)水平，有著較強(qiáng)的激酶活性，而PGSK-3β磷酸化蛋白在癌組織中的高水平表達(dá)，說明GSK-3β的激酶活性被明顯抑制。

值得關(guān)注的是，GSK-3β在腫瘤發(fā)生中具有矛盾的兩面性，不少抑制GSK-3β表達(dá)的實驗研究表明GSK-3β具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生的作用[9-10]。PGSK-3β作為失活形式并不直接表明GSK-3β的活性程度，因此盡管DKK-1、GSK-3β、PGSK-3β陽性表達(dá)預(yù)示了宮頸癌患者的不良預(yù)后，但具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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