伍 歡， 王進(jìn)鑫， 張 青， 劉俊峰， 鄒 朋

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院， 農(nóng)業(yè)部 西北植物營養(yǎng)與農(nóng)業(yè)環(huán)境重點實驗室， 陜西 楊凌 712100)

隨著經(jīng)濟(jì)社會的發(fā)展和氣候的變化，水資源短缺已成為全球性的生態(tài)問題。中國的干旱、半干旱、亞濕潤干旱地區(qū)的總面積為3.32×104km2，占國土總面積的34.6%[1]，主要分布在西北地區(qū)，西北干旱地區(qū)的鉛鋅礦石的儲量很大[2]，礦產(chǎn)的開采及加工對環(huán)境造成了極大破壞。鉛是一種不可降解的污染物，它不僅會影響植物和農(nóng)作物的生長，而且可以通過食物鏈進(jìn)入人體，對人的健康造成威脅。近年來，利用植物修復(fù)重金屬污染土壤的研究逐漸增多，大多數(shù)學(xué)者[3-5]對鉛富集植物和鉛對植物生理生化特性影響的研究主要集中在生長周期較短的農(nóng)作物和一年生草本植物上，有關(guān)鉛對木本植物生理生化特性影響的研究較少。木本植物較草本植物而言，具有生物量大、生長周期長和便于管理等優(yōu)勢，在重金屬污染土壤的修復(fù)方面具有很大潛力。目前相關(guān)的研究中缺乏針對西北鉛鋅礦區(qū)普遍存在的干旱和重金屬鉛雙重脅迫問題的研究。

為此，本研究選取中國西北干旱地區(qū)廣泛種植的耐旱性較強(qiáng)的木本植物紫穗槐(AmorphafruticosaL.)，研究紫穗槐苗木對干旱和鉛雙重脅迫的生理生化響應(yīng)機(jī)制，闡明紫穗槐苗木對逆境的抗性和適應(yīng)能力，這對木本植物資源開發(fā)以及干旱區(qū)礦業(yè)廢棄地植被恢復(fù)和重建具有重要的理論與實踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試苗木為一年生的紫穗槐(AmorphafruticosaL.)，采自陜西省楊凌區(qū)附近的苗圃。起苗前對圃地苗木進(jìn)行調(diào)查，選用地徑、株高和長勢基本一致的苗木。供試苗木平均苗高74.9±6.3 cm，平均地徑11.2±1.8 mm，苗齡為1 a。栽培基質(zhì)為塿土，質(zhì)地為重壤，田間持水量22.3%，土壤pH值8.24，土壤有機(jī)質(zhì)含量13.70 g/kg，全氮含量0.73 g/kg，速效磷含量35.91 mg/kg，速效鉀含量96.52 mg/kg，土壤鉛背景值16.3±2.96 mg/kg[6]。2011年12月，向土樣中加入99%的分析Pb(CH3COO)2·3H2O，充分混勻后鈍化2個月，以作備用。

1.2 試驗方法

試驗地布設(shè)于陜西省楊凌區(qū)西北農(nóng)林科技大學(xué)主校區(qū)人工旱棚內(nèi)。試驗采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，共設(shè)4個水分處理水平和5個鉛處理水平，共20個處理(表1)，每處理重復(fù)3次。4個水分處理水平分別為：土壤相對含水量(SWRC)100%(CK)，80%(輕微水分脅迫)，60%(輕度水分脅迫)和40%(重度水分脅迫)[7-9]。5個鉛處理水平分別為：0，1 000，2 000，4 000和6 000 mg/kg。2012年3月，將鈍化后的土樣盛入高30 cm，口徑27 cm的塑料容器中，按0—30 cm平均土壤容重1.15 g/cm3裝土,保證各容器中干土重一致。并將苗木移栽至容器，每容器1株紫穗槐，移栽前清洗苗木根部附著土壤。在紫穗槐苗木生長期間，采用稱重法控制土壤相對含水量，每3 d稱量1次，以便及時調(diào)整每日補(bǔ)充灌水量，同時，所有容器土表面覆蓋厚約2 cm的砂石以減少水分蒸發(fā)。試驗期間不施肥，使栽培基質(zhì)保持自然肥力。

表1 試驗處理及處理代碼

1.3 測定項目及方法

酶液的制備：于2012年5月18日上午采集紫穗槐葉片，每株均取新梢中部的成熟葉片，將采集后的葉片編號并置于4 ℃冷藏保存。每處理取0.5 g鮮葉片于預(yù)冷的研缽中，加入0.05 mol/L的冷磷酸緩沖液(pH值7.8)5 ml和少量石英砂，冰浴研磨。至勻漿后用0.05 mol/L的冷磷酸緩沖液(pH值7.8)5 ml沖洗，并轉(zhuǎn)移至離心管。10 000 rpm 4 ℃離心15 min，上清液即為酶提取液，將酶液轉(zhuǎn)移至試管，4 ℃冷藏保存，作為備用。

超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)法[10]測定，取酶液0.2 ml于試管中，加入核黃素、Met溶液、NBT溶液、EDTA—Na2溶液和蒸餾水，混勻后置于4 000 lx日光下反應(yīng)20 min；另設(shè)兩支以0.2 ml蒸餾水代替酶液的對照管，用黑色硬紙遮光。至反應(yīng)結(jié)束后，用黑布遮蓋試管，以終止反應(yīng)。反應(yīng)終止后于560 nm下測光密度(OD)值。SOD以抑制50% NBT發(fā)生光化學(xué)還原為1個酶活性單位。過氧化物酶(POD)采用愈創(chuàng)木酚顯色法[10]測定，取0.2 ml的酶液加入愈創(chuàng)木酚、蒸餾水和雙氧水搖勻反應(yīng)，最后以偏磷酸終止反應(yīng)，在470 nm下測OD值。POD以每1 min氧化1 μmol愈創(chuàng)木酚為1個酶活單位。過氧化氫酶(CAT)活性采用H紫外分光光度法測定[11]，每1 min記錄1次，以1 min內(nèi)OD 240值降低0.1為1個酶活單位。計算酶活性時葉片重量均以鮮重計。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，并用Duncan法進(jìn)行平均值之間的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水分和鉛雙重脅迫對紫穗槐苗木葉片SOD活性的影響

植物細(xì)胞在正常代謝過程中和在環(huán)境脅迫下均能產(chǎn)生活性氧和自由基，SOD是活性氧清除反應(yīng)過程中第一個發(fā)揮作用的抗氧化酶[12]，SOD活性的增加表明植物細(xì)胞清除超氧自由基的能力增強(qiáng)，植物的抗逆性也隨之增強(qiáng)。試驗結(jié)果(表2)表明，在單一鉛脅迫處理下，隨著鉛脅迫的加劇，紫穗槐苗木葉片的SOD活性呈先升高后降低的趨勢，且都顯著高于對照(CK)處理(p<0.05)，C處理(鉛含量為4 000 mg/kg)SOD活性達(dá)到最大值，為對照的124.06%；在單一水分脅迫處理下，SOD活性呈先升高后降低的趨勢，T1，T2處理均顯著高于對照處理(p<0.05)，T2處理(60% SWRC)SOD活性達(dá)到最大值，為對照的122.62%；表明單一的水分或鉛脅迫對紫穗槐苗木葉片的SOD活性有激活作用。在水分和鉛雙重脅迫處理下，SOD活性的變化比較復(fù)雜，但都顯著高于對照(p<0.05)，說明雙重脅迫對紫穗槐苗木葉片的SOD活性有一定的激活作用。雙重脅迫處理下，A處理組(鉛含量為1 000 mg/kg)，B 處理組(鉛含量為2 000 mg/kg)和C處理組(鉛含量為4 000 mg/kg)中，SOD活性均低于相應(yīng)的單一鉛脅迫處理(A,B,C處理)，說明此時水分脅迫和鉛脅迫之間的交互作用對紫穗槐苗木葉片的SOD活性的誘導(dǎo)表現(xiàn)為拮抗作用；D處理組(鉛含量為6 000 mg/kg)中，雙重脅迫下SOD活性均高于相應(yīng)的單一鉛脅迫處理(D處理)，說明此時水分脅迫和鉛脅迫之間的交互作用對紫穗槐苗木葉片的SOD活性的誘導(dǎo)表現(xiàn)為協(xié)同作用。在雙重脅迫處理下，SOD活性在AT1處理達(dá)到最大值，為對照處理的117.58%，且明顯高于對照處理(p<0.01)；在DT2處理達(dá)到最小值，為對照的105.76%。

表2 水分和鉛雙重脅迫處理下紫穗槐苗木葉片的SOD活性 U/g

2.2 水分和鉛雙重脅迫對紫穗槐苗木葉片POD活性的影響

POD在生物體內(nèi)的抗氧化代謝中具有關(guān)鍵作用，它主要清除氧代謝中產(chǎn)生的H2O2以及由此產(chǎn)生的過氧化物ROOH[13]，從而保護(hù)細(xì)胞。試驗結(jié)果(表3)表明，在單一鉛脅迫處理下，POD活性隨脅迫的加劇而呈升高趨勢，在D處理達(dá)到最大值，為對照的145.93%，但A，B處理與對照處理差異不顯著(p>0.05)，說明POD活性對低含量的鉛(≤2 000 mg/kg)脅迫不敏感；在單一水分脅迫處理下，POD活性隨脅迫的加劇呈先升高后降低的趨勢，且都明顯高于對照處理(p<0.01)，說明POD活性對水分脅迫較敏感，POD活性在T2處理達(dá)到最大值，為對照處理的165.41%。在雙重脅迫處理下，POD活性在AT3處理達(dá)到最大值，為對照的216.28%，在DT3處理達(dá)到最小值，為對照的101.45%。A處理組(鉛含量為1 000 mg/kg)和B處理組(鉛含量為2 000 mg/kg)中，在輕度水分脅迫(60% SWRC)和重度水分脅迫(40% SWRC)處理下POD活性均明顯高于相應(yīng)的單一鉛脅迫處理(p<0.01)，說明此時水分脅迫和鉛脅迫之間的交互作用對紫穗槐苗木葉片POD活性的誘導(dǎo)表現(xiàn)為協(xié)同作用；C處理組(鉛含量為4 000 mg/kg)和D處理組(鉛含量為6 000 mg/kg)中，除DT3處理的POD活性明顯低于相應(yīng)的單一鉛脅迫處理(D)外(p<0.01)，其他雙重脅迫處理的POD活性與相應(yīng)的單一鉛脅迫處理差異不顯著(p>0.05)，說明此時水分脅迫和鉛分脅迫之間的交互作用對紫穗槐苗木葉片的POD的活性的誘導(dǎo)沒有顯著影響，C處理組中POD活性高于相應(yīng)的單一鉛脅迫處理而D處理組中POD的活性均低于相應(yīng)的單一鉛脅迫處理，可能是由于高含量的鉛(6 000 mg/kg)和水分雙重脅迫對POD本身的酶蛋白結(jié)構(gòu)造成了破壞。

2.3 水分和鉛雙重脅迫對紫穗槐苗木葉片CAT活性的影響

CAT廣泛存在于各種植物組織中，其主要功能是催化細(xì)胞內(nèi)多余的H2O2分解，使細(xì)胞內(nèi)的H2O2維持在正常水平，從而使植物細(xì)胞免遭毒害，其活性的高低與植物的抗逆性有一定關(guān)聯(lián)[4,14]。試驗結(jié)果(表4)表明，在單一鉛脅迫處理下，CAT活性隨脅迫的加劇呈先升高后降低的趨勢，A,B,C處理的CAT活性均明顯高于對照(p<0.01)，在B處理達(dá)到最大值，為對照的189.50%，D處理的CAT活性均明顯低于對照(p<0.01)，為對照的26.20%，說明紫穗槐苗木葉片的CAT活性對鉛脅迫較敏感；在單一水分脅迫處理下，CAT活性隨脅迫的加劇呈先降低后升高的趨勢，且都明顯高于對照(p<0.01)，說明水分脅迫對紫穗槐苗木葉片的CAT活性有激活作用。在雙重脅迫處理下，各處理(除AT3處理外)的CAT活性均明顯低于相應(yīng)的單一水分脅迫處理(p<0.01)，說明水分脅迫和鉛脅迫之間的交互作用對紫穗槐苗木葉片的CAT活性的誘導(dǎo)表現(xiàn)為拮抗作用；當(dāng)鉛含量較低(≤2 000 mg/kg)時，各處理(除BT1處理外)的CAT活性均高于對照，說明此時雙重脅迫對CAT活性有激活作用；當(dāng)鉛含量較高(>2 000 mg/kg)時，各處理(除CT1處理外)的CAT活性均明顯低于對照(p<0.01)，說明此時雙重脅迫對CAT活性有抑制作用。

表3 水分和鉛雙重脅迫處理下紫穗槐苗木葉片的POD活性 U/(g·min)

表4 水分和鉛雙重脅迫處理下紫穗槐苗木葉片的CAT活性 U/(g·min)

3 討 論

植物在正常生長情況下，體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于平衡狀態(tài)，但在受到逆境脅迫時，植物細(xì)胞會產(chǎn)生過量的活性氧自由基，對細(xì)胞造成傷害[15]，植物經(jīng)過長期的進(jìn)化，自身已形成一套保護(hù)性酶系統(tǒng)，其中SOD，POD和CAT是植物體內(nèi)重要的保護(hù)性酶，它們對于清除細(xì)胞內(nèi)過量的活性氧、維持細(xì)胞的健康和穩(wěn)定具有重要作用。因此，保護(hù)性酶活性的高低在一定程度上反映了植物對逆境的耐受能力。

本研究中，在單一的鉛脅迫處理下，隨著脅迫的加劇，紫穗槐苗木葉片的SOD和CAT活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，而POD活性一直呈現(xiàn)升高趨勢，金琎等[16]對小麥保護(hù)酶系統(tǒng)的研究結(jié)果與此一致；紫穗槐苗木葉片的SOD活性和CAT活性對鉛脅迫較敏感，而POD活性對低含量的鉛(≤2 000 mg/kg)脅迫不敏感，陳麗娜等[17]對花芽甜麥菜的研究結(jié)果與此一致。這說明在鉛脅迫處理下，紫穗槐苗木葉片的SOD和CAT活性變化較POD活性而言更加迅速，是較敏感的生物指標(biāo)，但在高含量的鉛(≥2 000 mg/kg)脅迫處理下，SOD和CAT活性受到一定程度的抑制，而POD始終維持較高的活性、清除活性氧的能力不斷增加，表明POD在紫穗槐苗木抵抗高含量的鉛(≥2 000 mg/kg)污染中發(fā)揮了主要作用。

在單一的水分脅迫處理下，隨著脅迫的加劇，紫穗槐苗木葉片的SOD和POD活性均呈先升高后降低的趨勢，而CAT活性呈先降低后升高的趨勢，王霞等[18]對8種檉柳的研究和孫國榮等[19]對白樺實生苗的研究結(jié)果與此一致。這說明在水分脅迫下，紫穗槐苗木葉片的SOD和POD的調(diào)節(jié)能力是有限的，當(dāng)脅迫超過一定限度后，細(xì)胞會因為受損而導(dǎo)致酶活性下降，這與植物一般的應(yīng)激規(guī)律相符[20]，同時說明了水分脅迫破壞了紫穗槐保護(hù)酶系統(tǒng)的動態(tài)平衡，并且在水分脅迫下SOD，POD和CAT是相互協(xié)調(diào)從而起到調(diào)節(jié)作用的。

水分和鉛雙重脅迫下紫穗槐苗木葉片的SOD，POD和CAT活性的變化比較復(fù)雜。當(dāng)鉛含量小于6 000 mg/kg時，水分脅迫和鉛分脅迫之間的交互作用對紫穗槐苗木葉片的SOD活性的誘導(dǎo)表現(xiàn)為拮抗作用，對POD活性的誘導(dǎo)表現(xiàn)為協(xié)同作用(除AT1處理外)；當(dāng)鉛含量為6 000 mg/kg時，水分脅迫和鉛脅迫之間的交互作用對紫穗槐苗木葉片的SOD活性的誘導(dǎo)表現(xiàn)為協(xié)同作用，對POD活性的誘導(dǎo)表現(xiàn)為抑制作用；水分脅迫和鉛脅迫之間的交互作用對紫穗槐苗木葉片的CAT活性的誘導(dǎo)表現(xiàn)為拮抗作用(除AT3處理外)。雙重脅迫對紫穗槐苗木葉片的SOD和POD活性有顯著的激活作用(除AT1和DT3處理的POD活性與對照差異不顯著外)，對低鉛含量(≤2 000 mg/kg)處理的CAT活性有激活作用(除BT1處理外)，對高鉛含量(>2 000 mg/kg)處理的CAT活性有抑制作用(除CT1處理外)。說明雙重脅迫誘導(dǎo)了SOD和POD的活性，并且在低鉛含量(≤2 000 mg/kg)處理下也誘導(dǎo)了CAT活性，使紫穗槐苗木在雙重脅迫的逆境下產(chǎn)生一個強(qiáng)于正常條件的抗氧化酶系統(tǒng)，從而保護(hù)細(xì)胞，而高鉛含量(>2 000 mg/kg)下CAT活性的降低有可能是由于雙重脅迫導(dǎo)致了CAT本身酶蛋白結(jié)構(gòu)的破壞，這也說明了紫穗槐在雙重脅迫下具有較好的自我保護(hù)和調(diào)節(jié)能力，并且適度的雙重脅迫(鉛含量≤2 000 mg/kg，土壤相對含水量≥40%)有利于提高紫穗槐苗木對水分和鉛雙重脅迫的耐受性。

4 結(jié) 論

在水分和鉛雙重脅迫下，紫穗槐苗木葉片的SOD，POD和CAT活性的變化表明紫穗槐苗木對雙重脅迫具有良好的適應(yīng)能力和調(diào)節(jié)能力，并且適度的雙重脅迫(鉛含量≤2 000 mg/kg，土壤相對含水量≥40%)有利于提高紫穗槐苗木對水分和鉛雙重脅迫的耐受性。同時，由于紫穗槐生物量大，生長周期長，根、莖、葉發(fā)達(dá)，具有草本植物無法比擬的優(yōu)勢，因此，紫穗槐具備種植于干旱、半干旱地區(qū)礦業(yè)廢棄地及鉛污染土壤上的潛力。本研究僅對水分和鉛雙重脅迫下，紫穗槐苗木生長初期葉片的抗氧化酶活性變化進(jìn)行了初步探討，其他生長階段內(nèi)葉片的抗氧化酶活性變化及其機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

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