鄭欣，胡波，高順祥，劉德婧，孫銘娟，王梁華

（中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，上海 200433）

生物膜干涉法研究STX與適配體間的相互作用

鄭欣，胡波，高順祥，劉德婧，孫銘娟，王梁華Δ

（中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，上海 200433）

目的研究石房蛤毒素與其適配體間的相互作用。方法采用生物膜干涉法測定石房蛤毒素與適配體間的親和常數(shù)，結(jié)合常數(shù)及解離常數(shù)，以其類似物河豚毒素和隨機序列分析該適配體的特異性。結(jié)果該適配體可以與石房蛤毒素結(jié)合，Kd值為7.44μM，且不與河豚毒素結(jié)合。隨機序列以較低的親和力與石房蛤毒素結(jié)合。結(jié)論該適配體可以進行進一步優(yōu)化，提高其與石房蛤毒素的親和力與穩(wěn)定性，以用于石房蛤毒素的檢測，并用于石房蛤毒素的中毒治療。

適配體；石房蛤毒素；相互作用；膜干涉技術(shù)

石房蛤毒素（C10H17N7O4，STX）是目前已知的最強有力的神經(jīng)毒素之一，由海洋藻類合成后，富集于甲殼類和軟體動物中，與多種類似物共同組成麻痹性貝類毒素家族，會導(dǎo)致人類和海洋動物產(chǎn)生麻痹性貝類中毒［1-4］。該毒素主要通過阻斷可興奮細胞表面的鈉離子通道產(chǎn)生毒性效應(yīng)［5］。小鼠腹腔注射、靜脈注射以及口服的半數(shù)致死量LD50分別是8～10μg／kg，3.4μg／kg和260μg／kg［6］。為了保證人類的健康不受威脅，對石房蛤毒素進行監(jiān)測顯得尤為重要。

然而，檢測石房蛤毒素，尤其是快速檢測中最關(guān)鍵的部分是識別石房蛤毒素的元件［7］。核酸適配體，一小段寡核苷酸序列（DNA或RNA），能夠與多種靶分子如藥物，蛋白質(zhì)，其他無機或有機分子高親和力高特異性結(jié)合，已作為分析識別元件應(yīng)用于靶分子檢測，診斷，治療等多方面［8-11］。目前，已有大量適配體經(jīng)由SELEX（指數(shù)富集性配體系統(tǒng)進化）的方法從隨機寡核苷酸序列庫中篩選得到［12］。由于適配體的多種自身優(yōu)勢，包括其穩(wěn)定性，低免疫原性，易于自動化學(xué)合成等，適配體在生物傳感檢測，診斷，治療方面很有前景［13］。據(jù)報道，已有研究團隊篩選得到一條DNA適配體，APTSTX1，可以與STX特異性結(jié)合，有潛力作為候選的分析識別元件應(yīng)用于STX的快速高通量檢測中［7］。本文采用生物膜干涉的方法對該序列與STX的相互作用進行動態(tài)學(xué)研究以及非特異性分析，旨在為后期的適配體優(yōu)化提供實驗基礎(chǔ)，推進該適配體在STX檢測中的實際應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 適配體5'-biotin APTSTX1及隨機序列5'-biotin RANDOM均由上海生工生物工程有限公司合成。石房蛤毒素，河豚毒素TTX均購自臺灣Algal Science公司。PBS-T（10 mM磷酸鹽緩沖液、2.7 mM KCl、140 mM NaCl、0.05%吐溫－20、pH 7.4；購自Sigma公司）。實驗過程中所有試劑準備使用DEPC水（IDT公司）。生物膜干涉儀器（OctetRED 96系統(tǒng)，F(xiàn)orteBio公司），SSA芯片（加強型鏈霉親和素，F(xiàn)orteBio公司）。

1.2 適配體和毒素準備 將凍干5'-biotin APTSTX1及RANDOM溶于PBS-T中，倍比稀釋至1μM，95℃熱變性5min后立即0℃復(fù)性10 min，最后4℃放置，以便后期檢測分析使用。按照說明書STX干粉溶于3mM HCl中，配制成238μM的母液，然后倍比稀釋至23.80μM，11.90μM和5.95μM（PBS-T）。TTX溶液直接用PBS-T稀釋至30μM。

1.3 方法 采用生物膜干涉技術(shù)分析適配體與STX間的相互作用［14-15］。整個分析過程可以實時監(jiān)測。首先采用生物素-鏈霉親和素的方法經(jīng)過平衡（PBS-T，1 min），適配體耦合（5min），解離（PBS-T，5min）和平衡（PBS-T，2min）四個步驟將APTSTX1固定于SSA芯片上。然后，分別經(jīng)過靶分子STX（23.8μM，11.9μM和5.95μM）和TTX（30μM）的結(jié)合以及解離過程（各5min）得到響應(yīng)值。另外設(shè)置3個SSA對照芯片，分別只加入APTSTX1，STX，或者2者都不加的本底對照。同樣地，采用上述方法研究RANDOM與STX間的相互作用。對照芯片的響應(yīng)值借助Octet數(shù)據(jù)分析軟件CFR Part11 Version 6.x從樣品芯片的響應(yīng)值中扣除，同時經(jīng)過數(shù)據(jù)擬合得到適配體的結(jié)合常數(shù)Kon，解離常數(shù)Kdis以及親和常數(shù)KD值。

2 結(jié)果

2.1 APTSTX1與STX之間的相互作用 本文采用生物膜干涉的方法對APTSTX1與STX之間的相互作用進行實時分析，結(jié)果顯示STX可以與APTSTX1結(jié)合，并且隨著STX濃度的升高，響應(yīng)值升高，利用數(shù)據(jù)分析軟件采用1∶1結(jié)合模式對不同濃度STX的響應(yīng)曲線進行擬合，得到2者的結(jié)合解離曲線（見圖1），以及親和常數(shù)，結(jié)合常數(shù)和解離常數(shù)（見表1）。

圖1 不同濃度的STX（23.80μM，11.90μM和5.95μM）與APTSTX1之間的結(jié)合解離曲線Fig.1 The curve of association and dissociation of APTSTX1 with STX at23.80，11.90 and 5.95μM

表1 STX與適配體、隨機序列之間的親和參數(shù)Tab.1 Affinity parameters between STX and aptamer，random sequence

2.2 APTSTX1與STX間相互作用的特異性 采用高濃度的河豚毒素TTX以及隨機序列RANDOM作為對照進行生物膜干涉分析，以研究適配體APTSTX1與STX間相互作用的特異性。結(jié)果顯示，高濃度的TTX不能與APTSTX1相結(jié)合。而隨機序列RANDOM與STX之間有相互作用，經(jīng)過數(shù)據(jù)擬合分析得到其親和常數(shù)，結(jié)合常數(shù)和解離常數(shù)（見表1）。如表1所示，隨機序列RANDOM與STX之間的親和力遠低于APTSTX1。

3 討論

NHI研究團隊在2013年報道通過磁珠法篩選得到可以與小分子STX相結(jié)合的適配體，并通過SPR的方法證實2者可以結(jié)合，且隨機序列與STX并無非特異性結(jié)合，然而該報道并未給出2者的具體KD值。本實驗中，首次采用免標記的生物膜干涉技術(shù)［14-15］成功進行適配體與小分子靶標之間的相互作用研究，一旦靶分子與傳感器表面包被的適配體結(jié)合，即引起光學(xué)膜層厚度的變化，導(dǎo)致光學(xué)膜層2個表面的反射光所形成的干涉光譜的變化。根據(jù)響應(yīng)值，即干涉光譜的相位位移強度（nm），得到了游離狀態(tài)下的STX與適配體間的親和參數(shù)KD，結(jié)合常數(shù)kon以及解離常數(shù)kdis，實時觀察2者之間的作用情況，并對該序列的特異性進行了分析。結(jié)果顯示，STX與APTSTX1是可以相互結(jié)合的，而且是慢結(jié)合慢解離的過程。河豚毒素與石房蛤毒素相似，都是帶有胍胺基的生物堿類毒素，然而該序列與TTX不能結(jié)合，表明APTSTX1可以特異地與STX作用。

與前述報道所得的結(jié)果不同的是，本實驗結(jié)果顯示隨機序列RANDOM與STX也可以結(jié)合，但親和力低于APTSTX1約5倍，響應(yīng)值也較低。分析原因，可能是：STX帶較強的正電荷，而DNA適配體帶強負電荷，2者因為電荷的吸引產(chǎn)生相互作用。而由于靶分子誘導(dǎo)DNA進行再折疊也較常見，隨機序列與STX的誘導(dǎo)契合程度不及APTSTX1，故親和力較低。類似地，通過體外篩選得到的針對帶正電靶分子的適配體都可能存在這樣的情況。

雖然STX也會與隨機序列非特異性結(jié)合，但APTSTX1可以特異地結(jié)合STX，而不結(jié)合TTX，這表明APTSTX1仍可以作為分析識別元件應(yīng)用于STX的檢測或者中毒治療中。本實驗結(jié)果提示，該適配體可以進行進一步優(yōu)化以提高其親和力和穩(wěn)定性，從而促進它在各領(lǐng)域的應(yīng)用。本課題已對該適配體進行了優(yōu)化，親和力提高了30倍（數(shù)據(jù)未發(fā)表），有潛力作為分子識別元件用于石房蛤毒素的檢測或去除。

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（編校：吳茜）

Bio-Layer Interferometry in study of interaction between STX and aptamer

ZHENG Xin，HU Bo，GAO Shun-xiang，LIU De-jing，SUN Ming-juan，WANG Liang-huaΔ

（Department of Biochemistry and Molecular Biology，College of Basic Medical Sciences，Second Military Medical University，Shanghai200433，China）

ObjectiveTo study the interaction between STX and its aptamer.MethodsBio-Layer Interferometry was used to obtain the affinity constant，binding constant and dissociation constant of the aptamer against saxitoxin.An analogue of saxitoxin，tetrodotoxin，and a random sequence were analyzed as controls to study the specificity of the aptamer.ResultsThe aptamer could bind with saxitoxin with a Kd value of7.44μM withoutany interaction with tetrodotoxin.The random sequence could bind with saxitoxin with low affinity.ConclusionThe aptamer can be further optimized to improve its affinity and stability for the application in monitoring or poisoning treatment of saxitoxin.

Aptamer；saxitoxin；interaction；Bio-Layer Interferometry

R319

A

1005－1678（2014）09－0017－03

國家自然科學(xué)基金（2013AA092904）

鄭欣，女，碩士，研究方向：海洋生物毒素，E-mail：dearjanna＠126.com；通信作者，王梁華，男，博士、副教授，研究方向：海洋生物毒素，E-mail：wsh928＠hotmail.com。