張 亮，管慶霞，趙義軍，高佳翔，李永吉

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150040)

馬錢子堿為中藥馬錢子的有效成分，具有顯著的鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮等作用[1]，但其溶解度差，半衰期短，生物利用度較低.固體脂質(zhì)納米粒，物理穩(wěn)定性高，毒性低，兼有控釋和長(zhǎng)效制劑的優(yōu)勢(shì)，長(zhǎng)期以來(lái)成為口服和靜脈給藥制劑的研究熱點(diǎn)，是一種極具發(fā)展前景的新型給藥系統(tǒng)[2].本實(shí)驗(yàn)以馬錢子堿為模型藥物，采用乳化蒸發(fā)法制備馬錢子堿固體脂質(zhì)納米粒.固體脂質(zhì)納米粒的藥物包封率是處方工藝篩選與質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，也是其發(fā)揮療效的關(guān)鍵，而載藥固體脂質(zhì)納米粒包封率的測(cè)定，涉及游離藥物與固體脂質(zhì)納米粒的良好分離.本實(shí)驗(yàn)旨在采用葡聚糖凝膠法進(jìn)行分離，以HPLC測(cè)定溶液中馬錢子堿的質(zhì)量濃度，計(jì)算包封率，并為固體脂質(zhì)納米粒的包封率測(cè)定提供參考.

1 儀器與材料

Waters公司高效液相儀系統(tǒng)(2996 photodiode Array Detector，2695 separations module，Empower色譜工作站)；85-2A恒溫磁力攪拌器(金壇市榮華儀器制造公司)；AB265-S電子分析天平(德國(guó)梅特勒公司).

馬錢子堿原料藥(日本和光純藥株式會(huì)社)；馬錢子堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；Poloxamer 188(德國(guó)BASF公司)；卵磷脂(北京雙旋微生物培養(yǎng)制品廠)；單硬脂酸甘油酯(分析純，天津市化學(xué)試劑三廠)；葡聚糖G-50(美國(guó)Pharmacia公司)；色譜甲醇(Sigma 公司)；水為重蒸餾水，其他試劑均為市售分析純.

2 方法與結(jié)果

2.1 馬錢子堿固體脂質(zhì)納米粒的制備

采用乳化溶劑低溫固化法[3]制備馬錢子堿固體脂質(zhì)納米粒.將處方量的馬錢子堿和單甘脂溶于無(wú)水乙醇中，超聲溶解，再加入適量的卵磷脂，微熱形成有機(jī)相，另取處方量的泊洛沙姆188溶于水中，構(gòu)成水相.在攪拌下將有機(jī)相緩慢注入水相中，整個(gè)過(guò)程保持溫度脂質(zhì)材料熔點(diǎn)以上，繼續(xù)攪拌數(shù)小時(shí)，濃縮體積至原來(lái)的1/3左右，將所得的半透明體系快速混于另一低溫水相中，繼續(xù)攪拌固化，即得固體脂質(zhì)納米混懸液.

2.2 色譜條件

色譜柱：Dikma C18ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相∶甲醇(30%)∶水-乙酸-三乙胺(230∶2.4∶0.3)(70%)；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL.

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取馬錢子堿對(duì)照品5.06 mg，精密稱定，置50 mL的量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻得質(zhì)量濃度為 0.101 2 mg/mL的對(duì)照品貯備液.分別精密吸取對(duì)照品溶液0.2、0.6、1、2、3、4 mL至10 mL的量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，在“2.2”項(xiàng)下色譜條件下，進(jìn)樣10 μL，以峰面積Y對(duì)馬錢子堿質(zhì)量濃度X進(jìn)行回歸，求得回歸方程為:Y=0.1150X+0.1896(r=0.999 9).結(jié)果表明，馬錢子堿在2.024～40.48 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好.

2.4 精密度和回收率

在線性范圍內(nèi)配制馬錢子堿高、中、低質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，于1 d內(nèi)進(jìn)樣5次，分別計(jì)算回收率及日內(nèi)精密度.結(jié)果表明，回收率在99.3%～100.3%之間，日內(nèi)精密度值為1.2%，結(jié)果表明，該法靈敏度高、重復(fù)性好.

2.5 馬錢子堿固體脂質(zhì)納米粒包封率的測(cè)定

2.5.1 葡聚糖凝膠柱的裝填

取一定量Sephadex G-50，用蒸餾水浸泡，沸水浴上加熱30 min，使葡聚糖充分溶漲并除去氣泡，靜置，沉淀葡聚糖，然后填充到玻璃層析柱上，不斷加入蒸餾水，以除去氣泡.以水洗柱，平衡待用.

2.5.2 洗脫曲線的繪制

精密吸取馬錢子堿納米粒溶液1 mL，加于葡聚糖凝膠G-50柱頂部，以蒸餾水洗脫，流速1 mL/min，收集洗脫液，每份1 mL，共收集30份，過(guò)0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定，再將前15 mL每份分別用甲醇定容至2 mL，超聲靜置.上清液過(guò)0.22 μm的濾膜，取續(xù)濾液按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定，以洗脫體積為橫坐標(biāo)，溶液中馬錢子堿質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，制備洗脫曲線，結(jié)果見圖1.

圖1 馬錢子堿固體脂質(zhì)納米粒的洗脫曲線

2.5.3 柱回收率的測(cè)定

精密量取已知含量的游離馬錢子堿溶液1 mL，加于葡聚糖凝膠柱頂部，以蒸餾水洗脫，控制流速，收集20～30 mL洗脫液，用甲醇定容至50 mL量瓶中，搖勻.精密吸取10 μL溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定過(guò)柱后馬錢子堿的質(zhì)量濃度(見表1)，平均柱回收率為91%，RSD為1.5%，回收率較高，重現(xiàn)性較好，此方法可行.

表1 游離馬錢子堿的柱回收率測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.5.4 包封率的測(cè)定

精密量取馬錢子堿納米混懸液1 mL，上SephadexG-50柱，以蒸餾水洗脫，流速為1 mL/min，以試管收集7～14 mL洗脫液(含馬錢子堿的固體脂質(zhì)納米粒)，加入甲醇超聲破乳并定容至50 mL，靜置.上清液過(guò)0.22 μm的有機(jī)微孔濾膜，取續(xù)濾液按“2.2”項(xiàng)下條件測(cè)定質(zhì)量濃度，計(jì)算包封的藥物量，為WE.另外精密量取馬錢子堿納米混懸液1mL，用甲醇超聲破乳，定容至50mL，靜置，上清液過(guò)0.22μm的有機(jī)微孔濾膜，取續(xù)濾液按“2.2”項(xiàng)下條件測(cè)定質(zhì)量濃度，計(jì)算藥物總質(zhì)量濃度，為WTotal.以包封率(EE%)=WE/WTotal×100%計(jì)算，馬錢子堿平均包封率為68.13%，RSD值為0.59%.見表2.

表2 包封率測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討 論

1) 固體脂質(zhì)納米粒的包封率測(cè)定方法主要有透析法[4]、離心法[5]、和葡聚糖凝膠柱層析法等[6]，其原理均是采用一定的方法使包封藥物與游離藥物分離，測(cè)定二者的質(zhì)量濃度，計(jì)算包封率.本實(shí)驗(yàn)采用葡聚糖凝膠柱層析法，利用分子篩原理，依據(jù)分子的大小不同而得到分離.該法操作簡(jiǎn)單，避免了透析法耗時(shí)長(zhǎng)、被包封藥物易滲漏而造成結(jié)果偏低的缺點(diǎn)以及離心法在離心過(guò)程中可能發(fā)生的納米粒變形與破裂的不足.

2) 樣品處理時(shí)，根據(jù)納米粒載體材料和馬錢子堿的溶解性質(zhì)，選擇了甲醇、無(wú)水乙醇、丙酮、乙腈為破乳劑.結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇的破乳效果較好，加入后進(jìn)行超聲，可見溶液不帶藍(lán)色乳光(破乳完全)，最終選擇甲醇為破乳劑.

3) 本實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表明，葡聚糖凝膠柱層析法柱回收率較好，測(cè)得的包封率較高，此法適用于馬錢子堿固體脂質(zhì)納米粒的包封率測(cè)定.

參考文獻(xiàn)：

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[2] JORES K, HABERLAND A, WARTEWIG S,etal. Solid lipid nanoparticles and oil-loaded SLN studied by spectrofluorometry and Raman spectroscopy[J]. Pharmaceutical Research, 2005, 22(11): 1887-1897.

[3] 管慶霞, 郭玉巖, 趙權(quán)濤, 等. 正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選馬錢子堿固體脂質(zhì)納米粒制備工藝[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2012, 12(23): 3063.

[4] 李 同, 陳桐楷, 林華慶, 等. 石杉?jí)A甲固體脂質(zhì)納米粒包封率的測(cè)定方法研究[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào), 2010, 26(2): l12-ll4.

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[6] 李偉男，于 鑫,王瑩瑩，等.馬錢子總生物堿樹脂復(fù)合物的制備及結(jié)合機(jī)制[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，29(3)：265-270.