郭瑞琳,王 鑫，孟 穎，魏 靜，許丹丹，宋天雪

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 哈爾濱 150076)

透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid ,HA)是由N乙酰葡糖胺與D葡糖醛酸組成的黏多糖，是由肝間質(zhì)細(xì)胞的儲脂細(xì)胞合成、并通過肝內(nèi)皮細(xì)胞特異的透明質(zhì)酸酶水解的多聚長鏈化合物[1-2].透明質(zhì)酸分子在空間上呈剛性無規(guī)則卷曲的螺旋柱狀結(jié)構(gòu)，由于其流體力學(xué)特點(diǎn)使透明質(zhì)酸有高度黏彈性，良好的可塑性保濕性以及生物相容性，因此透明質(zhì)酸既可以作為化妝品原料又可用于制作功能性食品，在美容手術(shù)及醫(yī)藥領(lǐng)域同樣發(fā)揮著重要作用，有著良好的發(fā)展前景[3-6].在人體和動物的機(jī)體組織及細(xì)胞基質(zhì)中，透明質(zhì)酸結(jié)合著膠原、纖黏連蛋白，顯示出多種重要的生理功能，例如對細(xì)胞運(yùn)動、增殖、分化和穩(wěn)定細(xì)胞與組織的表現(xiàn)型等，均有重要作用[7].基于其特殊的保水性，可以維持自身千倍的水分子，使透明質(zhì)酸擁有良好的保濕性，在皮膚的真皮和表皮之間發(fā)揮著特殊的生理作用，防止膠原蛋白失水硬化，從而使肌膚維持柔嫩，延緩衰老，除此之外，透明質(zhì)酸還可以供給肌膚營養(yǎng)，加速受傷肌膚的愈合速度.透明質(zhì)酸還可以清除體內(nèi)由于紫外線照射產(chǎn)生的氧自由基，從而減慢機(jī)體衰老進(jìn)程，防止產(chǎn)生炎癥，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[8-9].近年來國內(nèi)外對透明質(zhì)酸保健食品進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸分子質(zhì)量不同對機(jī)體吸收能力也不同，機(jī)體對大分子質(zhì)量的透明質(zhì)酸消化和吸收效果較差，食用降解后的小分子會在機(jī)體內(nèi)合成為大分子質(zhì)量的透明質(zhì)酸，進(jìn)而發(fā)揮其重要作用[10-11].

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞冠 市售，標(biāo)準(zhǔn)透明質(zhì)酸 上海源葉生物科技有限公司，丙酮 天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心，正丁醇 天津市福晨化工試劑廠，氯仿 天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心，無水乙醇 天津市天力化學(xué)試劑有限公司，氯化鈉 天津市北方醫(yī)化學(xué)試劑廠.

TU-1900 紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FZ102微型植物粉碎機(jī)、R-205 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申勝生物技術(shù)有限公司； SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 浸泡

稱取20 g新鮮雞冠5份，用乙醇溶液浸泡雞冠至變硬并置于干燥箱中干燥，干燥后用植物型粉碎機(jī)將其粉碎.向粉碎的雞冠粉末加入6倍的去離子水于燒杯中，攪拌后靜置浸泡過夜.

1.2.2 除脂肪、蛋白

10%的固體氯化鈉加入濾液中，玻璃棒攪拌至氯化鈉完全溶解，加入等體積的氯仿、正丁醇溶液(氯仿∶正丁醇為4∶1)于分液漏斗中，攪拌3 h，取上層水相待用.以透明質(zhì)酸得率作為檢測指標(biāo)選擇最佳預(yù)處理溶液.

1.2.3 HA的單因素條件選擇

1)乙醇體積分?jǐn)?shù)單因素實(shí)驗(yàn)

量取5份預(yù)處理溶液，每份40 mL.將預(yù)處理的溶液按料液比1∶2 (g/mL)浸于80 %、85 %、90 %、95 %和100 %的乙醇溶液中，干燥24 h后沉淀物為HA粗品，計(jì)算HA得率，確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù).

2)料液比單因素實(shí)驗(yàn)

量取5份預(yù)處理溶液，每份40 mL.將預(yù)處理的溶液按料液比1∶1、2∶3、1∶2、2∶5和1∶3 (g/mL)加入90 %乙醇溶液中，干燥24 h后沉淀物為HA粗品，計(jì)算HA得率，確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù).

3)靜置時間單因素實(shí)驗(yàn)

量取5份預(yù)處理溶液，每份40 mL.將預(yù)處理的溶液按料液比1∶2 (g/mL)加入90 %乙醇中，二者混合分別靜置沉淀22、24、26、28、30 h，干燥后沉淀物即為HA粗品.計(jì)算HA得率，確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù).

1.2.4 HA最佳工藝條件的選擇

對乙醇浸泡雞冠實(shí)驗(yàn)進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，選取以下三因素為優(yōu)化自變量，根據(jù)Box-BenhnKen的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素結(jié)果，設(shè)計(jì)三元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合的響應(yīng)面分析試驗(yàn).見表1.

表1因素水平表

因素代碼編碼水平編碼值真實(shí)值-101時間/ hx1 X1242628料液比/ (g·mL-1)x2 X22∶32∶42∶5 乙醇體積分?jǐn)?shù)/ %x3 X3859095

注：編碼值與真實(shí)值之間的關(guān)系為：x1=(X1-3)/1；x2=(X2-1.3)/0.1；x3=(X3-6)/1.

1.2.5 定性定量分析實(shí)驗(yàn)

1)HA得率的測定

其中：W為HA得率，%；m為HA粗品量，g；M為雞冠干粉，g.

2) 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

量取20 mL濾液，以乙醇作為提取溶劑，根據(jù)響應(yīng)曲面法優(yōu)化雞冠中HA提取的最優(yōu)工藝條件，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn).

3) HA 定性分析試驗(yàn)

通過UV在OD值190～400 nm范圍內(nèi)掃描HA標(biāo)準(zhǔn)品及提取物，根據(jù)吸收峰來確定最大吸收波長，進(jìn)而比較HA標(biāo)品與樣品圖譜的出峰位置及峰形是否一致.

2 結(jié)果與討論

2.1 提取HA單因素結(jié)果與分析

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)單因素的選擇結(jié)果與分析

由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加HA得率有所增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%時，HA得率達(dá)到最高點(diǎn)，繼續(xù)提高乙醇體積分?jǐn)?shù)，HA得率呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢.由于HA具有高水溶性，乙醇具有價格低廉、無毒無害，并且有較好的吸水性，所以使用乙醇對其進(jìn)行沉淀，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大其吸水性增強(qiáng)，HA的得率增高，但乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到90%時吸水達(dá)到飽和，所以隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)大于90% HA的得率逐漸降低.因此，確定最佳提取乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%.

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對HA得率的影響

2.1.2 料液比單因素的選擇結(jié)果與分析

由圖2可知，料液比較小時HA的產(chǎn)量增加并不明顯，但是隨著料液比的增加HA的得率有了明顯的增高，這是由于隨著固相與液相比例加大時二者的接觸面積增大，使反應(yīng)充分固相內(nèi)物質(zhì)得到有效釋放，且由于物料充足反應(yīng)速度也大大提高，此時的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也最為明顯即為圖中料液比為2∶1點(diǎn)所示，HA得率達(dá)到最高值.隨后，隨著料液比的繼續(xù)增大HA的得率反而隨之減少，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是由于隨著液相高于固相過多導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)生的HA被多余的乙醇浸泡抑制了反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)速率及產(chǎn)量都受到影響.隨著料液比增大HA得率出現(xiàn)嚴(yán)重下滑趨勢.可見再增加更多的乙醇并沒有提高HA的得率反而析出多余的雜質(zhì)影響試驗(yàn)準(zhǔn)確性并增加了試驗(yàn)成本.因此，確定最佳提取料液比為1∶2.

圖2 料液比對HA得率的影響

2.1.3 沉淀時間單因素的選擇結(jié)果與分析

由圖3可知，隨著反應(yīng)時間的延長HA得率不斷增大.由于隨著反應(yīng)時間增加，溶質(zhì)在溶劑中得到充分溶解，使反應(yīng)完全，當(dāng)溶出的物質(zhì)達(dá)到一定體積分?jǐn)?shù)時反應(yīng)趨于平衡，如果繼續(xù)增加反應(yīng)時間則會使析出物質(zhì)被溶解，導(dǎo)致HA得率下降.當(dāng)反應(yīng)時間較短時，HA產(chǎn)量呈現(xiàn)明顯上升趨勢；隨著反應(yīng)時間的增加，HA產(chǎn)量上升趨勢逐漸減小，在沉淀時間26 h時HA產(chǎn)量達(dá)到最高點(diǎn)，若繼續(xù)延長時間，HA提取產(chǎn)量不在上升，并且呈下降趨勢.由此看出，靜置時間是影響HA得率的重要因素之一.但需要注意的是靜置時間過長也可能使HA的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，生物活性遭到到破壞，其中的有效成分不再被溶解，與此同時雜質(zhì)溶出的量也隨之增多，使實(shí)驗(yàn)誤差增大.因此，當(dāng)沉淀時間26 h，沉淀效果最佳.

圖3 時間對HA得率的影響

2.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化透明質(zhì)酸提取工藝條件結(jié)果與分析

響應(yīng)曲面二次多項(xiàng)式回歸模型設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表2.

表2試驗(yàn)結(jié)果表

組別時間/ h料液比/ (g·mL-1)乙醇體積分?jǐn)?shù)/ %HA得率/ %1234567891011121314151617-1 1 0110000 -10-11-10000 -10 1001000-110-110-1-1 0001 0100110-10-10-124.6323.8927.4524.4824.1227.4525.2627.4527.4525.2623.4724.8925.1924.1324.6927.4525.12

乙醇浸泡法提取雞冠中HA的試驗(yàn)結(jié)果見表3.利用Design Expert 7.1.3軟件對表的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化，獲得乙醇沉淀法提取雞冠中HA得率對提取時間(x1)、料液比(x2)和乙醇體積分?jǐn)?shù)(x3)的二次多項(xiàng)方程為：

Y=27.45-0.15x1+0.34x2-0.19x3-0.043x1x2-0.43x1x3-0.56x2x3-1.47x12-1.63x22-1.18x32

其中：Y為雞冠中HA的提取率；x1為提取時間,min；x2為料液比, g/mL；x3為乙醇體積分?jǐn)?shù)，%.

由表3可知，本試驗(yàn)所建立的模型非常顯著(P<0.000 1).該模型中僅有變異約為0.09%不能通過此模型來解釋；相關(guān)系數(shù)為R=0.9984，該模型擬合程度非常好，試驗(yàn)產(chǎn)生的誤差小，該模型是適用的.

表3模型方差分析表

變異源平方和自由度均方和F值P值模型失擬項(xiàng)純誤差總和32.560.0520.00032.61934163.620.0170.000488.69<0.0001R=0.998 4,R2=0.996 4,R2Adj=0.999 1

表4回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表

系數(shù)估計(jì)自由度標(biāo)準(zhǔn)差平方和F值P值模型x1x 2x 3x12x22x32x1x2x1x3x2x 327.45-0.150.34-0.19-1.47-1.63-1.18-0.043-0.43-0.5611111111110.038 80.0300.0300.0300.0420.0420.0420.0430.0430.04332.560.190.920.299.0811.245.887.225E-0030.721.23488.6925.54124.0039.011 226.851 517.98793.560.9897.59166.42< 0.000 1< 0.000 10.279 30.000 4< 0.000 1< 0.000 1< 0.000 10.356 1< 0.000 1< 0.000 1

2.2.1 料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)及其交互作用對提取透明質(zhì)酸的結(jié)果與分析

由圖4等高線圖可明顯地看出，提取時間為最佳值25.71 h.乙醇提取體積分?jǐn)?shù)和料液比兩個因素的交互作用比較顯著.在實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi)，乙醇體積分?jǐn)?shù)對HA產(chǎn)量的影響很大，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，HA產(chǎn)量迅速增加，乙醇體積分?jǐn)?shù)基本在85%～95%范圍內(nèi)，HA產(chǎn)量可達(dá)到本次實(shí)驗(yàn)中的最大值.料液比對HA產(chǎn)量也有很大的影響，但隨著料液比的增加，HA產(chǎn)量先增大后降低.觀察二者的等高線圖可以看出兩個因素的交互作用極顯著.在本次實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi)，料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)的值分別在2∶3 ～9∶5 (g/mL)和87%～90%的范圍內(nèi)，HA的得率達(dá)到試驗(yàn)最大值.

2.2.2 料液比和時間及其交互作用對提取透明質(zhì)酸的結(jié)果與分析

由圖5可以直觀地看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)為最佳89.93%時，觀察等高線圖，提取時間與料液比兩個因素之間的交互效果不顯著.在本次試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，提取時間對HA的得率影響不明顯，在22～30 h之間隨著濾液和乙醇體積分?jǐn)?shù)兩者之間料液比的增加，得率并沒有明顯的改變，當(dāng)提取時間較短時，HA的得率隨著時間的增加而增大，當(dāng)時間超過26 h時，HA的得率隨著提取時間的增加并沒有明顯提高.料液比和時間處于實(shí)驗(yàn)水平的中心點(diǎn)位置附近時，即料液比為1∶2 (g/mL)和時間約為26 h，HA得率最高．當(dāng)二者的水平過高或過低時，都會使HA得率下降.由等高線的形狀可直觀地看出此兩因素的交互作用不顯著(P>0.05).

圖4 料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)及其交互作用對提取透明質(zhì)酸的響應(yīng)曲面和等高線圖

圖5 料液比、時間及其交互作用對提取透明質(zhì)酸的響應(yīng)曲面和等高線圖

2.2.3 提取時間和乙醇提取體積分?jǐn)?shù)及其交互作用對提取透明質(zhì)酸的結(jié)果與分析

從圖6等高線圖可以直觀的看出，料液比為最佳100∶177 (g/mL)時，提取HA時間與乙醇提取體積分?jǐn)?shù)兩個因素之間的相互交互作用顯著，在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，乙醇體積分?jǐn)?shù)對HA的得率影響較大，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加HA的得率增大；提取時間較短時，HA得率隨時間的延長而增大，但當(dāng)提取時間超過26 h時，HA得率隨時間的延長而減小的幅度明顯.在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時間的值分別在87%～92%和24～26 h的范圍內(nèi)，此時HA的得率達(dá)到試驗(yàn)最大值.

通過響應(yīng)曲面分析，該模型確定提取HA的最佳工藝條件：提取時間為25.71 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)89.93%、料液比100∶177 (g/mL).

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

從綜合實(shí)際角度考慮，采用優(yōu)化后的工藝提取HA，即提取時間為25.70 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)90.00%、料液比100∶177 (g/mL)，該工藝制備透明質(zhì)酸得率為27.31%.

2.4 紫外光譜檢測結(jié)果分析

圖6 提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)及其交互作用對提取透明質(zhì)酸的響應(yīng)曲面和等高線圖

通過UV檢測確定標(biāo)準(zhǔn)HA在198 nm吸收波長處有穩(wěn)定的吸收峰.由圖7可知，確定HA最大的吸收波長為198 nm.在最大吸收峰198 nm處檢測HA樣品與HA標(biāo)品的最大出峰位置及峰形是一致的，可確定該提取物質(zhì)為HA.

圖7 透明質(zhì)酸紫外光譜掃描圖

3 結(jié) 語

以市售新鮮雞冠為原料研究了HA提取的最佳提取方法.分別選用了丙酮和乙醇預(yù)處理提取HA，以HA得率為評價指標(biāo)，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取工藝.確定乙醇處理的HA得率更高為24.85%，選擇乙醇為預(yù)處理溶劑，通過響應(yīng)曲面法分析，優(yōu)化HA提取工藝，確定條件為：提取時間為25.70 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)90.00%、料液比100∶177 (g/mL)，該工藝制備透明質(zhì)酸得率為27.31%，通過定性試驗(yàn)確定從新鮮雞冠中提取出的物質(zhì)與HA標(biāo)準(zhǔn)品的波長及峰值相同.最大吸收波長為198 nm，確定雞冠中提取物質(zhì)為HA.

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