趙轉(zhuǎn)霞，劉哲鵬*，董堃華，周逸明，徐強(qiáng)強(qiáng)

1. 上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院(上海， 200093) 2. 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院(上海, 200040)3. 上海蘇豪逸明制藥有限公司(上海， 200333)

奧曲肽長效生物可降解微球的制備及其分析方法研究

趙轉(zhuǎn)霞1，劉哲鵬1*，董堃華2，周逸明3，徐強(qiáng)強(qiáng)3

1. 上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院(上海， 200093) 2. 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院(上海, 200040)3. 上海蘇豪逸明制藥有限公司(上海， 200333)

目的運(yùn)用已正交優(yōu)化的復(fù)乳法制備三批奧曲肽PLGA長效生物可降解微球，并且建立有效的分析方法。方法利用HPLC、激光粒度儀與掃描電鏡等儀器對(duì)所制備的微球進(jìn)行綜合質(zhì)量研究。結(jié)果在該工藝條件下制得的三批微球包封率均為35%以上，載藥量為8.0%以上，平均粒徑為60μm左右,微球外觀圓整，形態(tài)良好。結(jié)論該制備工藝穩(wěn)定可靠，分析方法科學(xué)有效。

微球;奧曲肽;復(fù)乳法;分析方法

奧曲肽為一種人工合成的生長抑素類似物，具有多種生理活性，半衰期是天然抑素的30倍。目前主要治療肢端肥大癥等病癥，對(duì)胃酸、胰酶、胰高血糖素和胰島素的分泌也有抑制作用。但是作為多肽、蛋白質(zhì)類藥物具有分子量大, 在體內(nèi)外的穩(wěn)定性差, 容易降解, 生物半衰期短，生物膜通透性差等缺點(diǎn), 使得多肽、蛋白質(zhì)類藥物的臨床應(yīng)用大受限制[1]。

長效生物可降解微球，不僅能夠有效防止藥物在體內(nèi)的很快降解, 還能將藥物緩慢釋放從而達(dá)到長效緩釋靶向目的[2]。具有療效穩(wěn)定、毒副作用小 與用量少等特點(diǎn)[3]。

運(yùn)用復(fù)乳法(w/o/w)制備奧曲肽微球，解決了傳統(tǒng)的水包油法中藥物向外水相滲漏的問題[4]，提高了水溶性藥物的包封率。對(duì)復(fù)乳法制備醋酸奧曲肽微球及制備得到微球質(zhì)量開展研究，通過調(diào)整制備工藝與處方對(duì)復(fù)乳法的制備工藝進(jìn)行了完善。在已正交優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)工藝基礎(chǔ)上制得三批奧微球。當(dāng)前奧曲肽微球的質(zhì)量分析方法過于單一，沒有形成其綜合性整體質(zhì)量評(píng)價(jià)。本方法綜合采用HPLC，激光粒度儀等檢測方法與手段對(duì)微球包封率、載藥量與粒徑分布等性狀進(jìn)行研究，確立科學(xué)的分析方法，并考察制備方法的穩(wěn)定性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1試劑

PLGA聚乳酸-羥基乙酸共聚物 (50：50，來源于Corp-Birmingham 分子量38 000 )，奧曲肽(shanghaisoho-yimingpharmacentical co.ltd 批號(hào)090501 純度 99.5%)，二氯甲烷、甲醇、PVA(均為國藥滬試，分析純)，三批奧曲肽微球(自制，批號(hào)20120904-1,20120904-2,20120904-3)。

1.2儀器

島津LC-20A 高效液相色譜儀，winner2005 激光粒度儀，IKA RW20 機(jī)械攪拌器，SK5200lh 超聲儀，XSP-3C掃描電子顯微鏡。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1含量測定方法的建立

2.1.1 檢測波長確定

對(duì)奧曲肽進(jìn)行全波長掃描，選擇合適波長作為奧曲肽檢測波長。溶液條件：取奧曲肽原料藥適量，加pH=5.4的磷酸鹽溶液稀釋定容至100 mL容量瓶，配制成0.1 mg/mL溶液，進(jìn)行全波長掃描。

2.1.2 HPLC方法評(píng)價(jià)

高效液相HPLC條件：0.02 M 磷酸溶液-乙腈(75：25)進(jìn)行等度洗脫。檢測波長為214 nm；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；柱溫為30℃。

2.1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性

配制濃度為(5、10 、50 、 100 和500 )μg/mL 的奧曲肽溶液，進(jìn)樣，考察其標(biāo)準(zhǔn)曲線線性。

2.1.2.2 精密度

稱取奧曲肽適量，配制成濃度為0.1 mg/mL的溶液，過濾，考察進(jìn)樣精密度與中間精密度。

2.1.2.3 空白輔料的干擾試驗(yàn)

將PVA和PLGA分別溶解，配制成空白輔料，過濾，取續(xù)濾液，進(jìn)樣考察。

2.1.2.4 回收率試驗(yàn)

稱取3份空白微球，每份取3個(gè)樣品，奧曲肽樣品標(biāo)示量為30 mg，各加入相當(dāng)于標(biāo)示量的80%，100%和120%的醋酸奧曲肽，照上述方法測定含量。

2.1.2.5 定量限

稱取奧曲肽原料藥適量，配制成濃度0.1 mg/mL的溶液，并進(jìn)行適度稀釋，進(jìn)樣考察，計(jì)算S/N值。

2.1.2.6 溶液穩(wěn)定性考察

稱取奧曲肽適量，配制成濃度為0.1 mg/mL的溶液，過濾，取續(xù)濾液每隔2 h進(jìn)行重復(fù)進(jìn)樣，對(duì)奧曲肽原料進(jìn)行12 h的穩(wěn)定性考察。

2.1.2.7 專屬性考察

稱取奧曲肽適量，分別溶于高溫80℃、0.1 mol/L鹽酸、0.1 mol/L氫氧化鈉、5%雙氧水的4種溶液，放置1 h，考察樣品強(qiáng)制破壞后的專屬性。

2.1.3 含量測定

高效液相HPLC條件： 0.02 M 磷酸溶液-乙腈(75：25)進(jìn)行等度洗脫。檢測波長為214 nm；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL，主峰理論塔板數(shù)計(jì)算應(yīng)不低于3 000，分離度符合要求。

測定法：稱取制備的奧曲肽PLGA微球適量，將樣品在10 mL二氯甲烷中充分溶解。使用注射用水10 mL進(jìn)行6次萃取，合并萃取液，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加入25 mL乙腈，搖勻，加入蒸餾水定容至刻度，配制成約每1 mL中約含0.1 mg奧曲肽的溶液，搖勻，濾過，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

另,精密稱取奧曲肽對(duì)照品適量，用水稀釋制成每1 mL中約含0.1 mg奧曲肽的溶液，同法精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

2.2微球制備方法

經(jīng)一系列的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)[5]得到的最佳處方為：

(1) 內(nèi)水相藥物與中油相PLGA 的重量比為1∶5；

(2) 中油相PLGA 的濃度為10%(W/V)；

(3) 外水相為1% 的22 000 分子量PVA 水溶液；

(4) 中油相與外水相的體積比不小于為1∶50；

(5) 復(fù)乳化采用機(jī)械攪拌法，攪拌速度為1 200 rpm。

在此基礎(chǔ)上建立工藝流程簡圖如下：內(nèi)水相+中油相 → 混合溶液 → 攪拌乳化1 200 rpm → 初乳 → 加入外水相中 → 高速攪拌形成復(fù)乳,冷凍干燥。

2.3微球的質(zhì)量考察

2.3.1 微球形態(tài)的研究

形態(tài)觀察：取本品，用水洗去賦形劑成分，凍干，采用掃描電子顯微鏡觀察微球形態(tài)。

2.3.2 粒度及其分布

取本品，依法《中華人民共和國藥典》(2010年版)二部附錄Ⅸ E 粒度和粒度分布測定法中的光散射法進(jìn)行測定，用激光粒度儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并記錄微球的平均粒徑及其分布。

2.3.3 微球載藥量及包封率考察

運(yùn)用上述含量測定的方法來測定微球中的藥物含量，并計(jì)算出微球的載藥量和包封率。

(1)

(2)

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1含量測定方法驗(yàn)證結(jié)果

3.1.1 奧曲肽全波長掃描

奧曲肽溶液在214 nm,286 nm處均有吸收峰，經(jīng)吸收峰的比較，其檢測波長定為214 nm[6]。

3.1.2 HPLC方法評(píng)價(jià)結(jié)果

3.1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性 奧曲肽溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=10 046x,n=5,相關(guān)性系數(shù)R2= 0.999 8,得到的線性良好。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線性Fig.1 standard curve

3.1.2.2 精密度

進(jìn)樣精密度如表1所示，樣品精密度良好。

表1 進(jìn)樣精密度Tab.1 The accuracy test results

3.1.2.3 空白輔料干擾試驗(yàn)

考察輔料的干擾實(shí)驗(yàn)，見圖2～圖4空白溶劑、輔料的色譜圖，藥物與其他輔料峰分離良好。

圖2 空白溶劑色譜圖Fig.2 Chromatograms of Blank solvent

圖3 輔料PLGA對(duì)照色譜圖Fig.3 Chromatograms of accessory PLGA

圖4 輔料PVA對(duì)照色譜圖Fig.4 Chromatograms of accessory PVA

3.1.2.4 回收率考察

平均回收率為99.88%，RSD值為1.12%。

3.1.2.5 定量限考察

奧曲肽在該條件下的定量限為38.3 ng/mL，S/N為10.04，符合定量限要求。

3.1.2.6 溶液穩(wěn)定性的考察

穩(wěn)定性考察12 h，RSD值為0.11%，供試品穩(wěn)定性良好

3.1.2.7 專屬性考察

在高溫、酸、堿與氧化的條件下，主峰與各雜質(zhì)峰分離良好。

總結(jié),該液相方法經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證，科學(xué)可靠，可以運(yùn)用為奧曲肽微球的含量測定方法[8]。

3.2三批微球的質(zhì)量考察結(jié)果

用上述處方工藝參數(shù)制得三批微球，API投入量分別為31.31 mg，31.30 mg， 32.03 mg。制得微球總質(zhì)量收率為61.5%、62.3%、61.1%。

對(duì)三批微球進(jìn)行微球形態(tài)，粒徑分布，包封率，載藥量等指標(biāo)進(jìn)行考察，得到如下結(jié)果。

3.2.1 包封率及載藥量測定

三批微球的包封率都在35%以上(見表3)，在同類微球制備工藝相比，達(dá)到比較好的效果，說明該方法科學(xué)可靠。

表3 包封率與載藥量Tab.3 The envelopment rate and drug loadings

3.2.2 三批粒徑分布

微球粒徑的分布及形態(tài)對(duì)其緩釋效果有較大的影響, 具體粒徑分布系如表4 所示。從表4可以看出，得微球的粒徑分布比較集中，并且每批之間相差甚小，重現(xiàn)性好。

表4 樣品粒徑分布結(jié)果Tab.4 Particle size distribution results

3.2.3 掃描電鏡結(jié)果

三批微球在掃描電鏡觀察下微球形態(tài)圓整(見圖5)，微球表面光滑，微球粒徑大小基本集中在20 μm～80 μm之間，基本形態(tài)較為理想，為微球的長效緩釋提供了依據(jù)。

圖5 電鏡掃描圖Fig.5 Electron microscope scanning figure

3.3三批樣品質(zhì)量考察結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表5 三批樣品質(zhì)量考察結(jié)果Tab.5 Three batch sample quality inspection results

通過對(duì)三批微球全面科學(xué)的質(zhì)量考察，結(jié)果表明，在已經(jīng)優(yōu)化的工藝條件下制得微球的包封率及載藥量較高，微球形態(tài)良好，粒徑適中，重現(xiàn)性良好。

4 討論

在正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定了最佳工藝處方，并在該條件下制備得到三批樣品，建立綜合的質(zhì)量分析方法，通過對(duì)微球形態(tài)、粒度及分布、對(duì)載藥量等多個(gè)因素進(jìn)行考察，結(jié)果表明微球的形態(tài)良好，粒度分布集中，載藥量包封率達(dá)到甚至在原研之上。

該方法處方工藝簡單可控，分析方法科學(xué)可靠，有望實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

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StudyonPreparationandAnalysisofSustainedReleaseBiodegradableOctreotideMicrospheres

Zhao Zhuanxia1,Liu Zhepeng1,Dong Kunhua2,ZhouYiming3,Xu Qiangqaing3

1.School of Medical Instrument and Food Engineering,University of Shagnhai for Science and Technology(,Shanghai,200093) 2. Shanghai Institute of Pharmacetical Industry (Shanghai,200040,)3.ShanghaiI Sohoyiming Pharmaceticals Co.,Ltd (Shanghai,200333)

ObjectiveTo prepare three batches of biodegradable poly (DL-lactide-co-glycolide) (PLGA) microspheres with Octreotide inside with sustained release properties.MethodsOrthogonal optimized w/o/w craft was used to prepare the PLGA microspheres with Octreotide peptide inside. HPLC, microscope, and ultraviolet spectrophotometer were used to characterize the microspheres.ResultsThe average particle size of microspheres is aboat 60 μm and the microspheres are in shpere appearance. The encapsulation efficiency is over 35% and the drug loading rate is over 8.0%.ConclusionThe preparation method is stable and reliable and the analysis method is effective.

microsphere，octreotide,multiple emulsion method，the method of analysis

10.3969/j.issn.1674-1242.2014.03.007

趙轉(zhuǎn)霞，在讀碩士研究生

E-mail：zhaozhuanx1988@163.com

劉哲鵬，高級(jí)工程師，E-mail:

TQ464.7 TQ469

A

1674-1242(2014)03-0155-05

2014-06-24)