周蓮潔 張富春 王艷

GRAS家族是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，由最初發(fā)現(xiàn)的3個家族成員GAI、RGA和SCR的特征字母命名［1-4］。根據(jù)對GRAS家族基因分析將該家族分成了8個分支，分別為SCL3、SHR、PAT1、LISCL、DELLA、SCR、LS 和 HAM［5，6］。GRAS 家族基因在植物的生長發(fā)育過程中起著重要的作用，且不同分支發(fā)揮不同的功能，其中SHR-SCR和LS、HAM、PAT1及DELLA分支蛋白分別在根及腋芽的發(fā)育［7-11］、分生組織的維持［12］、光敏色素信號通路［13-15］及GA信號通路［16-18］等生物代謝過程中發(fā)揮作用。此外，很多GRAS家族蛋白還在植物逆境脅迫中發(fā)揮重要作用，并且成為近年來研究的熱點，如Torres-Galea等［14］檢測擬南芥PAT1分支AtSCL13表達模式時發(fā)現(xiàn)，在鹽、干旱、低溫等非生物脅迫及植物激素刺激下均能誘導表達AtSCL13；同屬PAT1分支的佛手GRAS基因，在低溫脅迫下其表達明顯上調(diào)［19］；卷心菜BoGRAS（SCL13）積極響應熱處理，可以作為卷心菜耐熱品種的分子標記基因［20］；水稻OsGRAS1基因在干旱、鹽及外源ABA誘導下表達上調(diào)；通過過表達胡楊GRAS基因SCL7，可以顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性和耐旱性［21］等。

鹽穗木（Halostachys caspica）屬藜科（Chnopodiaceo）鹽穗木屬（Halostachys），是鹽生、旱生稀鹽多汁半灌木，生長于荒漠地區(qū)鹽堿地、鹽湖邊及河岸，綠期長，是具有重要生態(tài)價值的鹽生植物［22，23］，常常成為鹽生植物群落的建群種或優(yōu)勢種［24］。HcSCL13是鹽穗木中發(fā)現(xiàn)的第一個具有典型C端保守結(jié)構(gòu)域的GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族基因，隸屬該家族PAT1分支，我們前期試驗發(fā)現(xiàn)該基因能夠積極響應鹽脅迫［25］，推斷其可能在鹽穗木耐鹽機制中發(fā)揮重要作用。

本研究將HcSCL13與酵母GAL4轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合域融合，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGBKT7-HcSCL13，并將其轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold，檢測HcSCL13誘餌蛋白對酵母細胞有無毒性作用和自激活活性，同時構(gòu)建該基因的植物過表達載體和亞細胞定位載體，旨在為闡述HcSCL13的耐鹽功能和作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以本實驗室保存的pMD18-T-HcSCL13為模板。PCR回收純化試劑盒購自TIANGEN公司；Ex Taq酶和限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；酵母雙雜交系統(tǒng)（MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System）、同源重組酶（In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit）、X-α-Gal、AureobasidinA（以下簡稱 AbA）、缺陷性培養(yǎng)基購自Clontech公司；PCR引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 酵母誘餌表達載體pGBKT7-HcSCL13的構(gòu)建及鑒定 以測序正確的質(zhì)粒pMD18-T-HcSCL13為模板，利用 DNAman軟件設計特異性引物，并分別在上游引物和下游引物的5' 端引入EcoR I和BamH I酶切位點，引物HcSCL13 baitP1：5'-CATGGAGG CCGAATTCATGCAAACATCTCAGCATGATTGC-3'；HcSCL13 baitP2：5'-GCAGGTCGACGGATCCTCACCT CCACGCAGAGGAAGATGA-3'。下劃線部分為同源重組序列。

PCR 擴增體系（20μL）：Ex Taq Buffer 2μL，dNTP Mix（2.5mmol/L）2μL，HcSCL13 baitP10.35μL，HcSCL13 baitP20.35μL，Ex Taq 聚合酶 0.3μL，ddH2O 14μL，cDNA 1μL。反應程序為 94℃ 5min；94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 2min，35個循環(huán)；72℃ 10min。1％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測PCR回收產(chǎn)物。取純化后的PCR產(chǎn)物和線性化的質(zhì)粒pGBKT7/EcoR I+BamH I進行同源重組，構(gòu)成pGBKT7-HcSCL13，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，在含Kan的LB平板上篩選陽性克隆，酶切鑒定正確后送北京華大公司測序。

1.2.2 誘餌表達載體pGBKT7-HcSCL13轉(zhuǎn)化酵母細胞Y2HGold 參考Clontech公司Gold yeast twohybrid system標準的操作方法制備酵母感受態(tài)細胞。取 0.1μg的重組質(zhì)粒 pGBKT7-HcSCL13，加入 50μg yeast carrier DNA與50μL Y2HGold感受態(tài)細胞混勻，再加入0.5mL PEG/LiAc溶液并混勻。30℃培養(yǎng)30min，加入 20μL DMSO，42℃水浴熱激 15min，離心后用1mL YPD plus medium重懸，30℃培養(yǎng)45min，離心并用1mL 0.9％ NaCl重懸，涂布在SD/-Trp固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3-5d。

1.2.3 誘餌蛋白的表達檢測 挑取陽性克隆，并接種于SD/-Trp液體培養(yǎng)基中至OD值達到0.8，離心沉淀酵母細胞，用抽提Buffer（0.1mol/L Tris-HCl，0.2mol/L NaCl，0.01mol/L β-巰基乙醇，20％ 甘油，5mmol/L EDTA，1mmol/L PMSF）重懸細胞，加入融壁酶（終濃度0.1U/mL）后于30℃、150r/min孵育30min，超聲破碎細胞，提取酵母蛋白。以c-Myc Monoclonal Antibody作為一抗（1∶1000稀釋），辣根過氧化物酶結(jié)合的羊抗小鼠IgG作為二抗（1∶5000稀釋），使用5％濃縮膠，12％分離膠進行Western blot檢測誘餌蛋白表達情況。

1.2.4 誘餌蛋白HcSCL13對酵母Y2HGold毒性的檢測 參照Clontech公司Gold yeast two-hybrid system標準的操作方法，將已轉(zhuǎn)化成功的酵母pGBKT7-HcSCL13/Y2HGold和空載酵母pGBKT7/Y2HGold分別涂在SD/-Trp固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3-5d，觀察菌落的大小，如果誘餌菌株的菌斑比對照組小，說明pGBKT7-HcSCL13對酵母Y2HGold有毒性；反之，說明沒有毒性。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄激活活性的鑒定 將鑒定正確的陽性克隆接種于SD/-Trp液體培養(yǎng)基中至OD值達到0.3，離心沉淀酵母細胞，用1mL 0.9％ NaCl重懸細胞。用酶標儀（Benchmark Plus，美國Bio Rad公司）測定菌液OD值，調(diào)整至OD值一致，以1、1/10和1/100倍比稀釋后分別涂布在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/X-α-Gal/AbA 和 SD/-Trp/-His/-Ade固體平板上，30℃培養(yǎng)3-4d，觀察酵母生長情況以及菌落的顏色變化，同時設立陰性對照pGBKT7-Lam/pGADT7-T/Y2HGold和陽性對照pGBKT7-53/pGADT7-T/Y2HGold。

1.2.6 植物表達載體的構(gòu)建及鑒定 用BamH I和Pst I雙酶切含有這兩個酶切位點的HcSCL13PCR產(chǎn)物，將回收的酶切產(chǎn)物與經(jīng)相同內(nèi)切酶回收的植物表達載體pCAMIA1301-1連接，使其上游連有花椰菜花葉病毒35S啟動子，下游連有NOS終止子，構(gòu)建成植物表達載體pCAMIA1301-1-HcSCL13，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，在含有Kan（50mg/L）的LB培養(yǎng)基上進行篩選，挑取單菌落提取質(zhì)粒，進行BamH I和Pst I雙酶切鑒定。酶切正確的克隆送華大有限公司北京分公司進行測序，測序正確后，采用凍融法將pCAMIA1301-1-HcSCL13導入農(nóng)桿菌EHAl05，為后續(xù)花序浸染擬南芥奠定基礎。

為使HcSCL13基因融合于GFP的N端，在HcSCL13基因上下游引物中分別添加了Nco I酶切位點（下游引物去除密碼子）。PCR產(chǎn)物用Nco I酶切后，連接到以相同酶切含有GFP基因的pCAMBIA1302載體上，構(gòu)建成HcSCL13目的基因C端連有mGFP的融合表達載體pCAMBIA1302-HcSCL13-mGFP。連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和篩選同上，挑取單菌落提取質(zhì)粒，進行NcoI酶切鑒定，同時再以Sph I和Hind III對重組質(zhì)粒pCAMIBA1302-HcSCL13-mGFP進行雙酶切，鑒定正向插入的克隆。以上酶切正確的克隆送華大有限公司北京分公司進行測序。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pGBKT7-HcSCL13的鑒定

根據(jù)HcSCL13基因已知全長序列，設計特異性引物，將擴增純化后的PCR產(chǎn)物與線性化的pGBKT7載體進行同源重組，獲得重組質(zhì)粒pGBKT7-HcSCL13。用引物HcSCL13baitP1和HcSCL13baitP2進行菌液PCR，得到了約1700bp的目的片段（圖1）。小量提取菌液PCR鑒定正確的質(zhì)粒，由于HcSCL13基因序列內(nèi)部含有EcoR I限制性內(nèi)切酶位點，故選用載體上游的Nco I和基因內(nèi)部的BamH I兩個限制性內(nèi)切酶消化重組質(zhì)粒，獲得了預期大小的目的片段（圖1）。

圖1 重組質(zhì)粒pGBKT7-HcSCL13的鑒定

2.2 pGBKT7-HcSCL13/Y2HGold酵母菌株的鑒定

將測序正確的 pGBKT7-HcSCL13/DH5α菌株提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化Y2HGold感受態(tài)細胞，在SD/-Trp固體培養(yǎng)基上30℃倒置培養(yǎng)3-5d，挑選單克隆在SD/-Trp液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)2d，用Easy Yeast Plasmid Isolation Kit提取酵母質(zhì)粒，通過質(zhì)粒PCR鑒定陽性克隆，結(jié)果（圖2）顯示，已成功獲得含重組質(zhì)粒的誘餌蛋白菌株。

圖2 陽性酵母克隆的質(zhì)粒PCR

2.3 誘餌蛋白的表達及毒性檢測

對鑒定正確的pGBKT7-HcSCL13/Y2HGold酵母菌株進行培養(yǎng)表達，經(jīng)Western blot檢測，結(jié)果（圖3-A）顯示，該菌株表達出80kD左右（理論大小79kD）的融合蛋白。將陽性重組菌株pGBKT7-HcSCL13/Y2HGold和空載對照pGBKT7/Y2HGold稀釋調(diào)整至相同的OD值，涂布在同一個的SD/-Trp平板上，培養(yǎng)3 d后平板上出現(xiàn)大小一致的菌落（圖3-B），因此認為表達的融合蛋白對酵母Y2HGold沒有毒性作用。

圖3 誘餌蛋白的表達（A）和毒性檢測（B）

2.4 誘餌蛋白的自激活檢測

將試驗重組菌株pGBKT7-HcSCL13/Y2HGold、陽性對照菌株pGBKT7-53/pGADT7-T/ Y2HGold和陰性對照菌株pGBKT7-Lam/pGADT7-T/Y2HGold稀釋調(diào)整至相同OD600值，分別涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/X-α-Gal/ AbA平板上進行自激活檢測，結(jié)果（圖4）顯示，含誘餌蛋白HcSCL13的菌株在SD/-Trp培養(yǎng)基上呈乳白色，而在SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/X-α-Gal/AbA培養(yǎng)基上呈現(xiàn)藍色菌落，在SDO/-His/-Ade培養(yǎng)基上也有菌落生長，與陽性對照表型一致，表明誘餌蛋白具有轉(zhuǎn)錄自激活活性。

2.5 植物表達載體的構(gòu)建及鑒定

將HcSCL13構(gòu)建至植物表達載體pCAMBIA13-01-1中，酶切鑒定片段大小正確（圖5泳道1），構(gòu)建成植物表達載體pCAMBIA1301-1-HcSCL13（圖6-A），經(jīng)測序HcSCL13讀碼框正確，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中。通過設計特異性引物擴增HcSCL13基因，使其融合于GFP的N端構(gòu)建成融合表達載體pCAMBIA1302-HcSCL13-mGFP（圖6-B），酶切鑒定片段大小正確（圖5泳道3）。為進一步確定目的基因連接方向的正確性，采用限制性內(nèi)切酶Sph I和Hind III切出了與預計大小一致的目的片段（圖5泳道2）。

圖4 HcSCL13誘餌蛋白自激活檢測

圖5 HcSCL13植物表達載體的酶切鑒定

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子又稱反式作用因子，是能與位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游 50-5000bp的順式作用元件、沉默子或增強子結(jié)合并參與調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄效率的一組蛋白，能將來自細胞表面的信息傳遞至細胞核內(nèi)［26］，通過與DNA序列及與其他蛋白間的相互作用激活或抑制轉(zhuǎn)錄。

GRAS家族是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，GRAS家族蛋白間及與其他蛋白間的相互作用在植物多種生長代謝和逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。其中，GRAS家族的DELLA分支蛋白在赤霉素（GA）信號轉(zhuǎn)導途徑中可以通過與GA受體GID1蛋白結(jié)合形成GA-GID1-DELLA 三聯(lián)復合體［27-29］，之后與SCFSLY1/GID2/SNE蛋白復合體中的F-box蛋白SLY1特異性結(jié)合，解除DELLA 蛋白的抑制作用，使植株表現(xiàn)出正常的 GA 反應和生長發(fā)育狀態(tài)［17，29，30］。而GRAS家族的另一分支蛋白SHR在根內(nèi)皮層的細胞層中與SCR相互作用，并在細胞核中形成復合物，阻止SHR運輸?shù)狡べ|(zhì)細胞層［31］；儲存在細胞核內(nèi)的復合物激活更多的SCR產(chǎn)生以保證足夠的SCR捕獲SHR到內(nèi)皮層的細胞層，從而使植物形成單層內(nèi)皮層。SCL21作為GRAS家族蛋白可以與PAT1相互作用，共同作用于光敏色素phyA的信號轉(zhuǎn)導［32］。苜蓿中，GRAS家族NSP1和NSP2能形成同源和異源多聚體并結(jié)合在早期結(jié)瘤素基因ENOD11啟動子上，調(diào)控早期結(jié)瘤素基因的表達［33］。此外，SCL13可與EFR5 結(jié)合并相互作用調(diào)節(jié)下游基因表達，在植物防御中發(fā)揮著重要作用，負調(diào)控植物的幾丁質(zhì)信號通路和真菌防御系統(tǒng)，而在水楊酸（SA）信號通路和細菌防御中起到正調(diào)控的作用［34］。以上結(jié)果表明GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子通過與其他蛋白相互作用在植物的生長發(fā)育和逆境防御中起重要調(diào)控作用。

圖6 HcSCL13植物表達載體pCAMBIA1301-1-HcSCL13（A）和pCAMIBA1302-HcSCL13-mGFP（B）構(gòu)建示意圖

本試驗所用的酵母菌株Y2HGold 帶有4個報告基因AUR1-C、MEL1、HIS3、ADE2。在酵母雙雜交GAL4系統(tǒng)基礎上構(gòu)建了鹽穗木GRAS家族蛋白基因HcSCL13的重組誘餌表達載體pGBKT7-HcSCL13，并將其轉(zhuǎn)染酵母菌Y2HGold中。通過X-α-Gal和金擔子素（AbA）篩選，pGBKT7-HcSCL13/Y2HGold和陽性對照pGBKT7-53/pGADT7-T/Y2HGold生長出藍色菌落，而陰性對照pGBKT7-Lam/pGADT7-T/Y2HGold無菌落出現(xiàn)，表明HcSCL13蛋白可作為轉(zhuǎn)錄因子激活報告基因AUR1-C和MEL1的表達。進一步使用His、Ade營養(yǎng)缺陷性培養(yǎng)基篩選，pGBKT7-HcSCL13/Y2HGold和陽性對照生長出菌落，而陰性對照無菌落出現(xiàn)，說明重組質(zhì)粒表達的蛋白也激活了下游報告基因HIS3、ADE2的表達。經(jīng)毒性檢測，pGBKT7-HcSCL13/Y2HGold菌株能夠在SD/-Trp培養(yǎng)基上正常生長，表明表達的重組融合蛋白對酵母菌株Y2HGold無毒性作用。由此可得出，HcSCL13重組蛋白對Y2HGold生長無毒性作用且具有轉(zhuǎn)錄自激活能力，表明HcSCL13具有轉(zhuǎn)錄激活域，是一類轉(zhuǎn)錄因子。

現(xiàn)階段，雖然已在擬南芥、水稻、佛手、胡楊、煙草等多種植物中發(fā)現(xiàn)了響應低溫、干旱、滲透和激素等逆境脅迫的GRAS家族基因。但對GRAS家族基因在植物抗逆過程中的具體作用機制尚不清楚，該家族在植物抗逆途徑中如何發(fā)揮作用還有待研究。從鹽穗木鹽抑制差減文庫中克隆得到的HcSCL13是GRAS家族成員，前期研究結(jié)果顯示，該基因能夠積極響應鹽脅迫，故推測HcSCL13可能在鹽穗木耐鹽途徑中發(fā)揮重要作用。而植物表達載體和亞細胞定位載體的成功構(gòu)建，為進一步利用農(nóng)桿菌介導法進行基因轉(zhuǎn)移、基因表達定位和功能研究奠定了基礎。此外，本試驗通過對HcSCL13誘餌蛋白載體的構(gòu)建和自激活檢測，驗證了該轉(zhuǎn)錄因子的自激活特性，為后續(xù)尋找HcSCL13轉(zhuǎn)錄激活域、篩選互作蛋白提供良好依據(jù)，同時為闡明HcSCL13蛋白在鹽穗木耐鹽途徑中發(fā)揮的作用奠定基礎。

4 結(jié)論

本試驗通過同源重組的方法成功構(gòu)建誘餌表達載體并獲得陽性酵母菌株pGBKT7-HcSCL13/Y2HGold，將其涂布在不同篩選培養(yǎng)基上，研究其轉(zhuǎn)錄激活活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HcSCL13重組蛋白對Y2HGold生長無毒性作用，并且能夠激活四種報告基因的表達。以上結(jié)果說明HcSCL13具有轉(zhuǎn)錄激活域，是一類轉(zhuǎn)錄因子。而植物表達載體和亞細胞定位載體的成功構(gòu)建，為進一步在體內(nèi)研究該基因功能奠定了基礎。

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