彭特 王丙云 李東升 陳志勝 陳勝鋒 計慧琴 陳金頂

在哺乳動物和人中，Oct4、Nanog和Sox2被認為是調(diào)控干細胞多能性及自我更新的3個重要的轉(zhuǎn)錄因子［1-3］，但它們在家禽干細胞中的作用存在爭議。2001年Soodeen等［4］研究表明，雞體內(nèi)不存在Oct4，Lavial等［5］的研究發(fā)現(xiàn)雞胚胎干細胞表達Oct4同源基因雞PouV（cPouV），并且對其多能性的調(diào)控有重要作用。本實驗室的前期研究顯示，在雞早期胚胎發(fā)育過程中，多能性相關基因cNanog、cPouV和Sox2顯著表達，但隨著胚胎發(fā)育3個基因的表達量呈明顯的下降趨勢，在雞胚胎干細胞分化的過程中，cNanog、cPouV和Sox2的表達水平也顯著下降，導致細胞多能性的喪失，提示這3個基因在維持雞胚胎干細胞多能性中發(fā)揮重要作用［6-8］。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是雙鏈RNA（dsRNA）介導的遺傳干擾現(xiàn)象，它能夠特異有效地降解mRNA，從而引起轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默，導致相應功能基因表型缺失［9］。1998年首次在秀麗線蟲中發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象，不久后在真菌、植物、果蠅、錐蟲、渦蟲、水螅、斑馬魚等真核生物中都發(fā)現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象［10，11］，RNA干擾技術(shù)具有高效、快速和成本低廉的優(yōu)勢，現(xiàn)已經(jīng)成為研究基因功能、新基因篩選、基因治療和尋找藥物靶點的重要工具［12，13］。

為進一步闡明cNanog和cPouV基因在雞胚胎干細胞多能性維持和自我更新中的作用，本試驗分別針對雞多能性相關基因cNanog和cPouV設計3對siRNA干擾片段，合成shRNA插入到干擾載體中，構(gòu)建siRNA表達載體，并對其進行篩選，以期獲得良好的干擾載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，為獲得cNanog和cPouV基因穩(wěn)定干擾的CES細胞株，闡明cNanog和cPouV基因在雞胚胎干細胞多能性調(diào)控中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮受精雞蛋（麻黃雞）購于廣東省佛山市南海種禽有限公司；pCMV-N-Flag、pSuper-Retro-Puro和pEGFP-N1質(zhì)粒由廣州醫(yī)科大學蔡銘升博士惠贈；實驗所用的限制性內(nèi)切酶、DNA Marker、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和RNAiso Plus均為大連TaKaRa公司產(chǎn)品；T4DNA連接酶為NEB公司產(chǎn)品；KOD酶購自東洋紡公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒為上海生工公司產(chǎn)品；DYKDDDDK-Tag Mouse mAb和Actin Mouse mAb為Abmart公司產(chǎn)品；山羊抗小鼠IgG（H+L）和超敏ECL化學發(fā)光試劑盒購自碧云天研究所；PVDF膜購自Millipore公司；寡核苷酸和引物由Invitrogen公司合成；測序由上海生工公司完成。

1.2 方法

1.2.1 cNanog和cPouV基因 siRNA 表達載體的構(gòu)建 根據(jù)siRNA的設計原則，通過Ambion公司在線siRNA靶位點設計軟件（http：//www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_tools.html）針對 cNanog（NM_001146142）和 cPouV（NM_001110178）基因分別設計3條寡聚核苷酸序列（表1）。合成的寡聚核苷酸配制成100μmol/L的濃度，與互補的寡聚核苷酸片段混合后用退火緩沖液（100mol/L NaCl、pH7.450mmol/L HEPES）稀釋成終濃度3pmol/L。90℃4min，70℃ 10min孵育，緩慢冷卻至室溫。退火后形成的shRNA連接到經(jīng)Bgl II和Hind III酶切的pSuper-Retro-Puro質(zhì)粒中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞、挑取克隆搖菌后送測序公司測序。提取測序正確的干擾載體，保存用于后續(xù)試驗，分別命名pS1-cNanog、pS2-cNanog、pS3-cNanog和 pS1-cPouV、pS2-cPouV、pS3-cPouV。

表 1 合成的用于構(gòu)建干擾載體的寡核苷酸序列

1.2.2 cNanog和cPouV全基因表達載體的構(gòu)建 用Clone Manager軟件設計擴增cNanog和cPouV基因的特異性引物，分別在擴增cNanog基因的引物引入BamH I和EcoR I，cPouV基因引入EcoR I和Sa lI酶切位點（表2）。采用本實驗室改進的方法取新鮮種雞蛋的胚盤［14］，按照說明書采用Trizol法提取總RNA，并用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和Oligo（dT）18引物合成cDNA，以合成的cDNA為模板按照下列參數(shù)進行PCR 擴增 ：94℃ 5min；94℃ 30s，退火 30s，72℃50s，循環(huán)35次；最后72℃ 10min。PCR 產(chǎn)物回收純化后用雙酶切，回收目的片段與經(jīng)同樣酶切及回收的pCMV-N-Flag載體連接，轉(zhuǎn)化后挑選陽性菌落進行PCR與酶切鑒定以及測序驗證，將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒分別命名為pCMV-Flag-cNanog和pCMVFlag-cPouV。

表2 cNanog和cPouV基因的PCR引物序列

1.2.3 pSuper-shRNA、pCMV-Flag重組表達載體和pGFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞 采用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染前1d選擇對數(shù)生長期的293T細胞接種于6孔板，待細胞生長至80％匯合時取4μg pSuper-shRNA、4μg pCMV-Flag 重 組 質(zhì) 粒 和 0.5μL pGFP-N1質(zhì)粒加入到100μL CaCl2溶液中，混勻，將混合液緩慢滴加入100μL 2×HBS中，劇烈混合后加入6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)細胞。

1.2.4 Western blot法檢測重組載體的干擾效果 3個siRNA表達載體和全基因表達載體以及pGFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞24h后，觀察熒光以確定轉(zhuǎn)染效率，然后提取細胞蛋白進行Western印跡，以未轉(zhuǎn)染siRNA表達載體組為陰性對照，β-actin作為內(nèi)源性對照。

293T細胞用預冷的PBS洗滌兩次，6孔板按100μL/孔加細胞裂解液，在冰上震蕩20min后重懸，12000g 4℃離心5min。經(jīng)SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。膜封閉后分別用抗Flag（1∶3000），抗 β-actin（1∶3000）抗體 4℃孵育過夜，與辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗（1∶1000）室溫反應1h，用化學發(fā)光法檢測目標基因在干擾前后的表達變化。

2 結(jié)果

2.1 siRNA 表達載體的構(gòu)建

用pSuper-Retro-Puro質(zhì)粒為基礎質(zhì)粒進行siRNA表達載體的構(gòu)建，載體含有氨芐抗性基因，表達載體連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布于LB氨芐青霉素抗性平板培養(yǎng)過夜，挑取單克隆培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒測序驗證與預期相符，部分測序結(jié)果見圖1。

圖1 重組質(zhì)粒pS3-cPouV的測序比對圖

2.2 cNanog和cPouV全基因表達載體構(gòu)建與鑒定

經(jīng)PCR擴增cNanog和cPouVcDNA編碼區(qū)全長，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果（圖2）顯示擴增出長約946bp的cNanog和905bp的cPouV目的片段；將重組質(zhì)粒pCMV-Flag-cNanog和pCMV-Flag-cPouV分別用BamH I、EcoR I和EcoR I、Sal I進行雙酶切后，電泳圖譜顯示分別切出與插入的預期目的大小相符的DNA 條帶（圖3）。進一步的測序結(jié)果表明，插入片段的核苷酸序列與GenBank公布的cNanog和cPouV參考序列完全相同，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 cNanog和cPouV目的片段PCR產(chǎn)物電泳圖譜

2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞效率的估測

載體轉(zhuǎn)染24h后，熒光顯微鏡下檢測 pGFP轉(zhuǎn)染效果，可見約70％-80％的293T細胞發(fā)出綠色熒光（圖4），由于共轉(zhuǎn)染時加入的pGFP質(zhì)粒的濃度及體積一樣，從側(cè)面可反映出重組干擾載體的轉(zhuǎn)染效率情況。表明磷酸鈣介導的重組干擾載體轉(zhuǎn)染293T細胞效率較高且不同質(zhì)粒間無明顯差異。上述試驗獨立重復5次以上，結(jié)果均一致。

圖3 pCMV-Flag重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物電泳圖譜

圖4 GFP與不同質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞表達情況（24h，100×）

2.4 cNanog和cPouV 干擾片段效率檢測

分別用cNanog和cPouV基因的3種pSupershRNA和pCMV-Flag重組表達載體共轉(zhuǎn)染293T細胞后，Western blot檢測結(jié)果（圖5）發(fā)現(xiàn)，所構(gòu)建的重組干擾載體均有一定的抑制靶基因表達的作用。其中針對cNanog基因的干擾載體中pS3-cNanog的抑制效果最明顯，pS2-cNanog次之；pSuper-cPouV-shRNA中pS3-cPouV重組載體的效果最好，pS1-cPouV和pS3-cPouV也有一定的抑制作用。上述試驗獨立重復3次，結(jié)果均一致。

3 討論

雞胚胎干細胞在胚胎發(fā)育基礎、轉(zhuǎn)基因禽類的生產(chǎn)及家禽育種等方面具有巨大的應用前景，但難以實現(xiàn)體外長期培養(yǎng)以及可傳代遺傳修飾，究其原因是對其全能性維持機制缺乏深入的了解。研究表明cNanog和cPouV在調(diào)控胚胎干細胞的自我更新和維持多能性上起重要作用，其在哺乳動物中的研究取得了較多的成果，但在家禽中研究報道很少。利用RNAi技術(shù)研究雞胚胎干細胞多能性相關基因的報道更是少之又少，在國內(nèi)尚未有見。本試驗成功構(gòu)建了針對多能性相關基因cNanog和cPouV的重組干擾載體，以期進一步深入研究其在雞胚胎干細胞中的生物學功能。

圖5 轉(zhuǎn)染pSuper-shRNA 24h后cNanog和cPouV蛋白表達水平

siRNA的獲得方法有多種，包括化學合成、體外轉(zhuǎn)錄、長片段dsRNAs經(jīng)RNaseIII類降解、siRNA表達載體或者病毒載體在細胞中表達、siRNA表達框在細胞中表達等，前3種方法的最大缺點是都需要直接操作RNA，操作不便，并且siRNA進入細胞后容易降解，RNAi效應維持時間短。為了克服這些不足，本研究采用了基于pSuper質(zhì)粒表達siRNA的方式進行RNAi，不僅降低了制備siRNA的成本，簡化了操作，而且延長了siRNA作用時間，便于篩選穩(wěn)定表達細胞系用于研究基因的長期功能。pSuper質(zhì)粒含有RNA聚合酶III識別H1啟動子和一個5-6個連續(xù)的胸腺嘧啶（T）構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄終止位點以及選擇標記［15］。本試驗合成的寡核苷酸包含所選序列的正義和反義序列間用一段9nt的鏈（5'-TTCAAGAGA-3'）連接；同時還包含5個連續(xù)的T作為RNA聚合酶III的終止信號，預測體內(nèi)轉(zhuǎn)錄后會形成3'端兩個U突出的莖部為19bp，環(huán)為9bp的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)，從而有效模擬RNA i過程中間體［16］。且pSuper質(zhì)粒帶有Puro標簽，轉(zhuǎn)染細胞后，可使用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達目的蛋白的細胞株。采用的真核表達載體pCMV-N-Flag的啟動子CMV可以高效啟動目的蛋白cNanog和cPouV在293T細胞中的表達，含有1個可以編碼Flag標簽的序列，可以表達出含有Flag標簽的融合蛋白，便于使用抗Flag的抗體來識別目的蛋白，有利于目的蛋白檢測。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞的方法有多種，如電穿孔法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體法和病毒介導法等，本試驗采取的磷酸鈣轉(zhuǎn)染法操作簡便，易于得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，但對pH值要求較高且重復性差，因此每種質(zhì)粒都反復進行了多次轉(zhuǎn)染以保持穩(wěn)定，轉(zhuǎn)染結(jié)果不僅進一步證實了表達載體pCMV-Flag和pSuper-Retro-Puro重組質(zhì)?？梢赞D(zhuǎn)染293T細胞，而且具有較高的轉(zhuǎn)染效率。

4 結(jié)論

本試驗首先構(gòu)建多能性相關基因cNanog和cPouV真核表達載體與pSuper-shRNA干擾載體，鑒定插入片段與預期相符后，共轉(zhuǎn)染293T細胞以表達目的蛋白。再采用Western blotting對構(gòu)建的重組干擾載體進行檢測與篩選，在β-actin表達量保持相對一致時，加入重組干擾質(zhì)粒組的靶基因蛋白表達量較對照組有所下降，表明構(gòu)建的pSuper-shRNA能特異性抑制靶基因的表達，且不同位點的序列抑制效果不同。

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