張紅霞 劉艷 李玲萍 賀忠梅

基礎(chǔ)研究

微創(chuàng)建立小鼠心肌梗死模型及其評(píng)價(jià)

張紅霞 劉艷 李玲萍 賀忠梅

作者單位：030001 太原市，山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系，細(xì)胞生理學(xué)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

目的 探索一種微創(chuàng)建立小鼠心肌梗死模型的方法，并利用超聲心動(dòng)圖進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法 40只C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為心梗組（MI，n=30）與假手術(shù)組（Sham，n=10）。術(shù)前及術(shù)中用異氟烷對(duì)動(dòng)物行吸入麻醉，于左胸3、4肋間做一1.0 cm左右切口，將心臟從胸壁窗口擠出。MI組結(jié)扎冠脈左前降支建立心梗模型；Sham組冠脈只穿線不結(jié)扎，其余操作同MI組。術(shù)后4周采用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心臟結(jié)構(gòu)與功能，經(jīng)心肌組織病理學(xué)分析以判斷模型成功與否。結(jié)果 MI組小鼠存活率為78.6%，Sham組為100%。超聲結(jié)果顯示，與Sham組相比，MI組小鼠的LVAWd、LVAWs、EF及FS均明顯降低（P＜0.05），LVIDd與LVIDs明顯增加（P＜0.05）。Masson染色可見(jiàn)MI組小鼠的左心室腔明顯增大，心室壁變薄，纖維化面積增加［（13.54±1.39）%比（0.08±0.03）%，P＜0.01］。結(jié)論 采用本法制備小鼠心梗模型具有微創(chuàng)、快捷、高效、無(wú)需使用呼吸機(jī)的優(yōu)勢(shì)，而且模型穩(wěn)定可靠。

心肌梗死； 動(dòng)物模型； 微創(chuàng)； 超聲心動(dòng)圖

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是一種發(fā)生率和病死率極高的嚴(yán)重病癥，對(duì)其發(fā)病機(jī)制與防治策略的研究需要高效穩(wěn)定的動(dòng)物模型。隨著心臟再生醫(yī)學(xué)與心肌干細(xì)胞移植技術(shù)的迅速發(fā)展，利用小鼠建立心肌梗死模型進(jìn)行的研究逐漸受到青睞[1]。常用的小鼠心梗模型制備時(shí)需要?dú)夤芮虚_(kāi)或經(jīng)口氣管插管和呼吸機(jī)輔助通氣[2]，這些操作不僅使手術(shù)時(shí)間延長(zhǎng)，而且也增加小鼠的創(chuàng)傷與感染概率，術(shù)中和術(shù)后動(dòng)物的死亡率較高而使成模率降低。我們探索出一種微創(chuàng)、快捷、高效、無(wú)需使用呼吸機(jī)的小鼠心梗模型制備方法，以期為缺血性心臟病的研究提供有效的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57BL/6雄性小鼠40只，8周齡，體重（22±4）g（購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。主要儀器與試劑：小動(dòng)物氣體麻醉機(jī)（XGI-8，Gas Anesthesia System），小動(dòng)物超聲儀（Visual Sonics Vev-o770），病理切片機(jī)（LEICA RM2235），Masson三色染色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司），3-0、6-0 polypropylene手術(shù)縫線，顯微外科手術(shù)器械（北京中興名業(yè)科技發(fā)展有限公司），異氟烷（上海雅培制藥有限公司），75%酒精（太原來(lái)寶生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 手術(shù)過(guò)程 術(shù)前采用小動(dòng)物氣體麻醉機(jī)對(duì)小鼠麻醉，手術(shù)時(shí)將小鼠鼻腔始終置于氣體麻醉機(jī)的面罩之中，以維持麻醉狀態(tài)。在小鼠背部墊用少許紗布，使其呈半右側(cè)臥位，并將小鼠四肢固定于手術(shù)臺(tái)。用75%乙醇消毒切口部位皮毛，于胸骨左緣第3、4肋間位置沿腋窩與胸骨下端連線剪一個(gè)1.5 cm橫向切口，用3-0手術(shù)縫合線對(duì)切口做一個(gè)荷包松結(jié)備用。隨后鈍性分離胸部肌肉，暴露第4肋間。采用蚊式止血鉗于第4肋間開(kāi)一個(gè)小口，此時(shí)由于體位原因心尖自然上翹，心底血管不扭曲易于暴露；撕開(kāi)心包，將止血鉗微微張開(kāi)，左手食指、中指從右胸側(cè)壁向左前推擠，拇指配合將心臟從胸壁窗口輕輕擠出。仔細(xì)觀察心臟表面血管，用6-0絲線在心大靜脈處進(jìn)針結(jié)扎（因冠脈左前降支位于心大靜脈下方），進(jìn)針深度控制在1 mm左右，結(jié)扎時(shí)要注意力度適宜，以防撕裂心肌。當(dāng)左心室前壁顏色變蒼白并伴有一過(guò)性心律失常則視為結(jié)扎成功，立即將心臟送入胸腔內(nèi)，排盡胸腔空氣，系緊荷包。本手術(shù)方法全程僅需2～3 min，摘除麻醉面罩后，小鼠1 min左右即可蘇醒。

采用上述方法建立心梗組（MI組，n=30），假手術(shù)組（Sham組，n=10）除不結(jié)扎冠脈外其余操作同MI組。根據(jù)我們的前期實(shí)驗(yàn)，心梗術(shù)后4周，心臟的結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生明顯改變，因此本研究所選時(shí)間點(diǎn)為手術(shù)后4周。

1.2.2 術(shù)后護(hù)理 術(shù)后將小鼠放入清潔鼠籠，自制水袋加熱，溫度維持在35℃左右，待完全清醒后轉(zhuǎn)入普通鼠籠中。體質(zhì)較弱者應(yīng)單獨(dú)存放，以防被同籠小鼠擠壓致死。術(shù)后4周內(nèi)監(jiān)測(cè)記錄小鼠的活動(dòng)與存活狀況。

1.2.3 超聲心動(dòng)圖檢測(cè) 術(shù)后4周將兩組小鼠胸部脫毛，以1%異氟烷吸入麻醉，仰臥位固定，取胸骨旁短軸觀切面，利用小動(dòng)物超聲儀（Visual Sonics Vevo770），M型超聲模式下記錄心臟結(jié)構(gòu)與功能參數(shù)。選用RMV707B探頭，頻率設(shè)置為37.5 MHz，探頭置于小鼠左側(cè)胸前，2D超聲示左室短軸切面，在乳頭肌水平應(yīng)用M模式超聲記錄左心室運(yùn)動(dòng)情況，包括左室前壁收縮末期厚度（LVAWs）、左室前壁舒張末期厚度（LVAWd）、左室后壁收縮末期厚度（LVPWs）、左室后壁舒張末期厚度（LVPWd）、左室收縮期內(nèi)徑（LVIDs）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）和射血分?jǐn)?shù)（EF），根據(jù)以下公式計(jì)算左室短 軸 縮 短 率 （LVFS）：LVFS=［（LVIDd-LVIDs）/LVIDd］×100%。所有測(cè)量取連續(xù)5個(gè)心動(dòng)周期的平均值。

1.2.4 心臟組織病理學(xué)檢測(cè) 超聲測(cè)定完畢后處死小鼠，取左心室制作組織病理切片，進(jìn)行Masson染色，以確定心肌纖維化程度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s表示，兩組心功能比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠術(shù)后存活情況 MI組小鼠在術(shù)中死亡2只，分別緣于失血性休克和室顫；術(shù)后一周有6只因心臟破裂、肺部感染及心力衰竭死亡，到術(shù)后4周存活數(shù)為22只，除去術(shù)中意外死亡，實(shí)際存活率為78.6%。Sham組小鼠存活率為100%。

2.2 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果 從表1可見(jiàn)，與Sham組相比，MI組小鼠 LVAWd、LVAWs、EF 及 FS 均明顯降低（P＜0.05），LVIDd與 LVID s明顯增加（P＜0.05）。提示小鼠MI術(shù)后4周，出現(xiàn)心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)和心功能降低，符合MI的病理特征。

2.3 病理分析 心肌組織Masson染色結(jié)果如圖1所示?？梢?jiàn)MI組的左心室腔明顯增大，心室壁變薄，纖維化面積增加［（13.54±1.39）%比（0.08±0.03）%，P＜0.01］。這一結(jié)果說(shuō)明，本研究采用的手術(shù)方法復(fù)制心梗模型成功。

表1 兩組小鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果（±s）

表1 兩組小鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05

組別 例數(shù) LVAWd（mm） LVPWd（mm） LVIDd（mm） LVAWs（mm） LVPWs（mm） LVIDs（mm） EF（%） FS（%）Sham 組 22 0.82±0.04 0.66±0.02 3.74±0.15 0.93±0.05 0.81±0.07 2.81±0.12 55.31±3.30 26.13±0.47 MI組 10 0.47±0.04a0.62±0.06 4.22±0.08a0.60±0.09a0.80±0.07 3.75±0.51a42.08±1.86a21.70±0.97a

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外復(fù)制心肌梗死動(dòng)物模型多選用結(jié)扎、藥物、冷凍、栓塞、電凝等方法，其中結(jié)扎冠脈左前降支的MI模型因梗死部位和分布范圍相對(duì)一致，并且病理生理改變與臨床心梗更為相似而被廣泛采用[3]。隨著轉(zhuǎn)基因及基因敲除小鼠的出現(xiàn)，小鼠已成為科研工作中的主要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。但是在小鼠MI制備過(guò)程中，因其體積較小而使外科手術(shù)的操作難度增大，且小鼠的耐創(chuàng)傷性弱，肺損傷和失血是手術(shù)過(guò)程中造成死亡的主要原因[4]。因此，盡可能減少制備過(guò)程中的創(chuàng)傷是提高小鼠MI建模效率的關(guān)鍵。

本研究中，我們采用對(duì)小鼠行吸入麻醉下結(jié)扎冠脈而建立MI模型。手術(shù)在1.0 cm左右切口下只需2～3 min即可完成，并且在術(shù)后4周通過(guò)超聲心動(dòng)圖和心肌組織Masson染色確定MI模型復(fù)制成功。由于手術(shù)切口小，動(dòng)物出血少，加之無(wú)需氣管切開(kāi)或經(jīng)口氣管插管進(jìn)行呼吸機(jī)輔助通氣，從而減輕對(duì)動(dòng)物的創(chuàng)傷，因此是一種微創(chuàng)、快捷、高效的小鼠MI模型制備方法。

超聲心動(dòng)圖檢查由于操作簡(jiǎn)便無(wú)創(chuàng)傷，可連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)心臟的結(jié)構(gòu)與功能，已成為目前常用的小動(dòng)物心臟評(píng)價(jià)方法[5]。心肌梗死會(huì)出現(xiàn)梗死周邊區(qū)心肌缺血和心室重塑，二者的持續(xù)發(fā)展可直接累及心功能[6]，其中左室重構(gòu)是梗死后心肌組織結(jié)構(gòu)和心室大小、形態(tài)及功能變化的病理生理過(guò)程，是影響梗死后患者的心臟血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)和AMI心臟事件發(fā)生率及遠(yuǎn)期預(yù)后的主要原因[7，8]。本實(shí)驗(yàn)中我們采用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)了術(shù)后4周小鼠的心臟參數(shù)，發(fā)現(xiàn)心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)和心臟功能降低，符合MI的病理特征。此外，Masson染色結(jié)果也表明心肌發(fā)生重構(gòu)，說(shuō)明本手術(shù)方法復(fù)制的小鼠MI模型成功。

多數(shù)MI模型復(fù)制時(shí)要進(jìn)行氣管切開(kāi)或經(jīng)口氣管插管進(jìn)行呼吸機(jī)輔助通氣，但氣管插管無(wú)疑增加了手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)和成本；同時(shí)氣管切開(kāi)、分離、插管、縫合等一系列操作、術(shù)后小鼠恢復(fù)平穩(wěn)自主呼吸才能脫離呼吸機(jī)都將延長(zhǎng)手術(shù)過(guò)程，使得手術(shù)對(duì)麻藥選擇、給藥方式、劑量等有諸多要求。而麻醉深淺、呼吸機(jī)參數(shù)調(diào)整及氣管插管導(dǎo)致的創(chuàng)傷等因素的差異，也造成實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性差[9]。我們?cè)谑中g(shù)過(guò)程中采用吸入麻醉的方法，保持動(dòng)物自主呼吸，從而避免氣管插管對(duì)呼吸道的損傷，提高模型的存活率。

本MI模型制備方法的主要優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)捷和對(duì)動(dòng)物損傷小，但是對(duì)手術(shù)者的技能要求較高，需要通過(guò)反復(fù)練習(xí)和不斷總結(jié)，在掌握熟練手法的基礎(chǔ)上保持模型的一致和穩(wěn)定。

（本文圖片第383頁(yè)）

［1］Huang G，Pashmforoush M，Chung B，et al.The role of cardiac electrophysiology in myocardial regenerative stem cell therapy.J Cardiovasc Transl Res，2011，4：61-65.

［2］盧記明，張炳熙.大鼠氣管插管方法學(xué)概述.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19：76-80.

［3］李峰杰，李貽奎,心肌梗死動(dòng)物模型研究進(jìn)展.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2013，29：5-10.

［4］Gao E，Koch WJ.A novel and efficient model of coronary artery ligation in the mouse.Methods Mol Biol，2013，1037：299-311.

［5］Qin FZ，Siwik DA，Luptak I，et al.The polyphenols resveratrol and s17834 prevent the structural and functional sequelae of diet-induced metabolic heart disease in mice. Circulation，2012，125：1757-1764.

［6］陰艷萍，高宇平，呂吉元，等.β1-AR阻斷劑聯(lián)合β2-AR激動(dòng)劑對(duì)心肌梗死大鼠心功能的影響及機(jī)制.中國(guó)心血管病研究，2013，11：463-467.

［7］劉曉玲，胡桃紅.急性心肌梗死后左室重構(gòu)的診斷及干預(yù).中國(guó)心血管病研究，2009，7：238-240.

［8］曾憲珍，張蕾，劉劍剛.影響急性心肌梗死后早期心室重構(gòu)的細(xì)胞外基質(zhì)研究進(jìn)展.中國(guó)心血管病研究，2011，9：520-523.

［9］魏峰，張靜，韓克，等.非人工通氣下大鼠急性心肌梗死模型的建立.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2010，31：699-702.

Minimally invasive established mouse model of myocardial infarction and evaluation

ZHANG Hong-xia，LIU Yan，LI Ling-ping，et al.Department of Physiology，Shanxi Medical University，State Key Laboratory of Cellular Physiology，Taiyuan 030001，China

Objective To explore a minimally invasive method of establishing mouse model of myocardial infarction,and to evaluate the cardiac function by echocardiography.Methods 40 male C57BL/6 mice were randomly divided into myocardial infarction group（MI，n=30）and sham group（Sham，n=10）.Hearts were manually exposed through an about 1.0 cm incision of the left fourth intercostal space after anesthesia with inhalation of Isoflurane.In MI group the left anterior descending coronary artery was ligated to establish myocardial infarction model.Hearts from sham group were without ligation with the rest of the operation the same as MI group.Cardiac structure and function were determined by echocardiography 4 weeks after operation,with histopathological analysis of myocardial to determine whether the model is successful.Results The survival rate of MI group was 78.6%and the Sham group was 100%.Echocardiography showed that LVAWd,LVAWs，EF and FS were significantly decreased（P＜0.05），LVIDd and LVIDs significantly increased（P＜0.05）in MI group compared with the Sham group.Masson staining showed markedly enlarged in left ventricular，thin ventricular walls，increased fibrosis area［（13.54±1.39）%vs （0.08±0.03）%，P＜0.01］.Conclusion This fast and efficient method of MI in mice minimally invasive and without using the ventilator，in addition，the model is stable and reliable.

Myocardial infarction； Animal model； Minimally invasive； Echocardiography

HE Zhong-mei，E-mail：hezmei@126.com；

山西省自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號(hào)：2012011040-7）；醫(yī)學(xué)電生理四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金（項(xiàng)目編號(hào)：2011-02）

賀忠梅，E-mail：hezmei@126.com；張紅霞，E-mail：zhxzhxzhx123456@126.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2014.04.014

Q95-33；R542.2+2

A

1672-5301（2014）04-0334－03

2014-01-09）

ZHANG Hong-xia，E-mail：zhxzhxzhx123456@126.com