劉軍海，耿敬章

(1.陜西理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中 723001；2.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001)

超聲輔助提取銀杏酸工藝優(yōu)化試驗(yàn)

劉軍海1，耿敬章2

(1.陜西理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中 723001；2.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001)

以銀杏外種皮為原料，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用二次回歸正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲輔助提取銀杏皮中銀杏酸的工藝條件。結(jié)果表明，超聲輔助提取銀杏皮中銀杏酸的最優(yōu)工藝條件為：超聲波頻率25 kHz、料液比1∶26 g·mL-1、提取時(shí)間1.83 h、提取溫度56 ℃，銀杏酸提取率為1.91%。

超聲波輔助；二次回歸正交試驗(yàn)；銀杏酸；提取工藝

銀杏(GinkgobilobaL.)為銀杏科(Ginkoaceae)銀杏屬植物，銀杏中主要的活性物質(zhì)是銀杏黃酮類、銀杏內(nèi)酯和銀杏酸。目前已知的銀杏酸主要包括白果酸、氫化白果酸、氫化白果亞酸和白果新酸[1-3]。據(jù)報(bào)道，銀杏酸具有潛在的致敏性、致突變作用和強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性，可引起嚴(yán)重的過敏反應(yīng)、基因突變、神經(jīng)損傷，痙攣和神經(jīng)麻痹等不良反應(yīng)[4-5]，對(duì)煙曲霉、赭曲霉、串珠鐮刀菌、申珠鐮刀菌等多種真菌和細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用[6]。銀杏外種皮是銀杏果仁的皮層，其銀杏酸含量比銀杏葉、銀杏果肉高。超聲輔助提取具有多種優(yōu)點(diǎn)，近年來在天然產(chǎn)物深加工領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。本文采用二次回歸正交法對(duì)銀杏外種皮中銀杏酸提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為銀杏資源的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 原料、試劑

原料銀杏購于當(dāng)?shù)刂兴幉呐l(fā)市場，人工取皮，烘干粉碎后過60目篩，置電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中備用；銀杏酸標(biāo)準(zhǔn)品，純度>99%，上海同田生物技術(shù)股份有限公司；甲醇、環(huán)己烷、石油醚、乙酸乙酯、冰醋酸等試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

JBT/C-YCL400/3P(D) 超聲波藥用提取機(jī)(濟(jì)寧金百特電子有限公司)；Cary50型紫外可見分光光度計(jì)(美國瓦里安公司)；Agilent 1260高效液相色譜法儀(賽譜銳思(北京)科技有限公司)；ZF-7型三用紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)；FW117中草藥粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)；DGG-9140B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信試驗(yàn)儀器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；GR-200電子天平(日本AND)等。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，用無水甲醇溶解，定容至100 mL，即配成質(zhì)量濃度為40 mg·L-1的貯備液。分別量取貯備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻。在分光光度計(jì)242 nm處測(cè)定其吸光度值，得到242 nm處標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為：y=0.02275x+0.00135(R=0.997)。

1.4 銀杏酸的提取流程

稱取銀杏外種皮粉末1 g→加入正已烷→超聲輔助提取銀杏酸→提取液過濾→取濾液1.0 mL→揮干溶劑→甲醇溶解→242 nm處測(cè)定吸光度值→計(jì)算提取率。

1.5 原料中銀杏酸含量的測(cè)定

稱取外種皮粉末2 g，加入150 mL正已烷索氏回流提取12 h，提取液用正已烷定容至100 mL。量取提取液10 mL于80 ℃水浴中濃縮至干，用75%甲醇5 mL溶解后，采用微量注射器吸取1 mL在薄層板上進(jìn)行條狀點(diǎn)樣，展開劑(石油醚∶乙酸乙酯∶冰醋酸=17∶1∶2)展開后，在三用紫外儀(254 nm)下，選取藍(lán)色熒光部分物質(zhì)進(jìn)行甲醇洗脫，定容至10 mL，微孔濾膜過濾后用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定銀杏酸得率。色譜條件為C18色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-2%冰醋酸水溶液(90∶10 V/V)；流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長310 nm；柱溫45 ℃；進(jìn)樣量20 μL，外標(biāo)法計(jì)算，以確定銀杏酸得率[7-8]。

1.6 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.6.1 單因素試驗(yàn) 單因素試驗(yàn)主要研究不同超聲頻率(10、20、30、40、50、60 kHz)、料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g·mL-1)、提取時(shí)間(1、1.5、2、2.5、3、3.5 h)、提取溫度(30、40、50、60、70、80 ℃)4個(gè)因素對(duì)銀杏酸提取效果的影響。

1.6.2 二次回歸正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用二次回歸正交試驗(yàn)進(jìn)行提取工藝優(yōu)化。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表1。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 各因素對(duì)提取效果的影響

2.1.1 超聲波頻率對(duì)銀杏酸提取率的影響 在提取溫度60 ℃、料液比1∶30 g·mL-1、提取時(shí)間2 h條件下，不同超聲波頻率對(duì)銀杏酸提取率的影響見表2。由表2可知，在30 kHz超聲條件下，銀杏酸的提取效果較好。這是由于超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈空化效應(yīng)，高加速度，粉碎和攪拌作用，增加了溶劑穿透力，加速了提取物的溶解，因此提取率較高。在頻率為30 kHz時(shí)，銀杏外種皮內(nèi)的纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)已基本破壞完全，再增加頻率，銀杏酸提取率變化不大。

表1 二次回歸正交試驗(yàn)因素及水平表

表2 超聲波頻率對(duì)銀杏酸提取率的影響

2.1.2 料液比對(duì)銀杏酸提取率的影響 在超聲波頻率30 kHz、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間2 h條件下，不同料液比對(duì)銀杏酸提取率的影響見表3。由表3可知，隨著料液比的提高，提取率相應(yīng)增加，在料液比達(dá)到1∶25 g·mL-1時(shí)提取率基本不變，故料液比選1∶25 g·mL-1。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)銀杏酸提取率的影響 在超聲波頻率30 kHz、料液比1∶25 g·mL-1、提取溫度60 ℃條件下，不同提取時(shí)間對(duì)銀杏酸提取率的影響見表4。由表4可知，隨著提取時(shí)間的增加，提取率相應(yīng)增加，3 h以后基本趨于不變；但時(shí)間過長，粗提液雜質(zhì)較多，所以3 h提取效果較好。

表3 不同料液比對(duì)銀杏酸提取效果的影響

2.1.4 提取溫度對(duì)銀杏酸提取率的影響 在超聲波頻率30 kHz、提取時(shí)間3 h、料液比1∶25 g·mL-1條件下，不同提取溫度對(duì)銀杏酸提取率的影響見表5。由表5可知，隨著溫度的升高，提取率相應(yīng)增加；但提取溫度過高，提取溶劑揮發(fā)，且銀杏酸結(jié)構(gòu)會(huì)有一定程度破壞，因此選70 ℃為提取較適宜溫度。

2.2 二次回歸正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 試驗(yàn)結(jié)果 以提取率(Y)為響應(yīng)值，按表1進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表6。

2.2.2 試驗(yàn)結(jié)果方差分析 采用SAS 8.01軟件對(duì)表6數(shù)據(jù)進(jìn)行四元非線性回歸分析(多項(xiàng)式回歸)[6]，試驗(yàn)結(jié)果的方差分析見表7、回歸方程的方差分析見表8，預(yù)測(cè)分析見表9。

表4 提取時(shí)間對(duì)銀杏酸提取效果的影響

表5 提取溫度對(duì)銀杏酸提取效果的影響

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

表7試驗(yàn)結(jié)果的方差分析表明，回歸方程的模型F值為31.96129，Pr=0.0001<0.01，說明這種試驗(yàn)方法是可靠的。交互項(xiàng)中X1×X2達(dá)到非常顯著統(tǒng)計(jì)程度(Pr<0.01)，X1×X3和X2×X3達(dá)到顯著統(tǒng)計(jì)程度(Pr<0.05)，說明超聲輔助提取銀杏酸時(shí)，各因素交互作用對(duì)提取率有較大影響，即X1(超聲波頻率)與X2(料液比)的交互作用非常顯著，X1(超聲波頻率)與X3(提取時(shí)間)、X2(料液比)與X3(提取時(shí)間) 的交互作用顯著。因此，在實(shí)際操作過程中，當(dāng)操作條件發(fā)生改變時(shí)，應(yīng)根據(jù)因素間的交互作用適當(dāng)調(diào)節(jié)其他因素。如當(dāng)超聲波頻率發(fā)生改變時(shí)，可調(diào)節(jié)料液比和提取時(shí)間，以保證有較高的提取率。

由表8可知，一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)均已達(dá)到非常顯著統(tǒng)計(jì)水平，方程達(dá)到非常顯著的統(tǒng)計(jì)程度(P=0.0001<0.01)；相關(guān)系數(shù)R2=0.9552，表明自變量(提取率)和因變量(各影響因素)之間有極顯著的回歸關(guān)系，說明模型可用于超聲波輔助提取銀杏酸提取率的預(yù)測(cè)，可為實(shí)際應(yīng)用提供參考。

由表9可知，超聲波頻率(X1)和提取時(shí)間(X3)對(duì)銀杏酸提取率為負(fù)效應(yīng)，料液比(X2)和提取溫度(X4)為正效應(yīng)，各因素的二次項(xiàng)均為負(fù)效應(yīng)。一次項(xiàng)的X3和X4，交互項(xiàng)的X1×X2、X1×X3和X2×X3，以及各二次項(xiàng)最具預(yù)測(cè)力，其余的變量則無顯著預(yù)測(cè)力。結(jié)合表7分析結(jié)果，進(jìn)一步說明在銀杏酸提取過程中，各因素的交互作用對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有較大的影響[9]。

表7 試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

表8 回歸方程的方差分析

表9 試驗(yàn)結(jié)果的預(yù)測(cè)分析

決定系數(shù)R2=93.41%，即剔除變量后，回歸方程自變量的變化可以解釋93.41%的因變量變化，這主要是銀杏酸提取過程受較多因素影響，方程未計(jì)入全部變量，另外也由于試驗(yàn)誤差，因此決定系數(shù)減小，但剔除變量后的方程達(dá)到0.01顯著統(tǒng)計(jì)程度，結(jié)果較為理想。

對(duì)此方程分別對(duì)X1、X2、X3、X4求偏導(dǎo)，并等于零?？汕蟮肵1=-0.052948、X2=0.0361642、X3=0.137973、X4=-0.345157，最大值1.911。由此可求得最佳工藝條件，并考慮到實(shí)際操作的便利性，則超聲波頻率25 kHz、料液比1∶26 g·mL-1、提取時(shí)間1.83 h、提取溫度56 ℃，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果銀杏酸提取率為1.91%。經(jīng)HPLC測(cè)定，銀杏酸得率為94.6%。

3 結(jié)論

1) 二次回歸正交試驗(yàn)結(jié)果表明，采用超聲輔助提取銀杏皮中銀杏酸的最佳工藝條件為：超聲波頻率25 kHz、料液比1∶26 g·mL-1、提取時(shí)間1.83 h、提取溫度56 ℃。在此條件下，銀杏酸提取率為1.91%。

2) 在銀杏酸提取過程中，各因素的交互作用對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有較大的影響。當(dāng)操作條件發(fā)生改變時(shí)，應(yīng)根據(jù)因素間的交互作用適當(dāng)調(diào)節(jié)其他因素，以保證有較高的提取率。試驗(yàn)結(jié)果對(duì)于銀杏資源的開發(fā)利用具有一定的指導(dǎo)意義。

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Technical Optimization Experiment of Ultrasonic-Assisted Extraction of Ginkgoic Acid

LIU Jun-hai1，GENG Jing-zhang2

(1.CollegeofChemistry&EngineeringScience，ShanxiUniversityofTechnology，Hanzhong723001，Shanxi，China；2.CollegeofBiologicalScience&Environment，ShanxiUniversityofTechnology，Hanzhong723001，Shanxi，China)

Ginkgoic acid was extracted through ultrasonic aids to use seed coat of ginkgo as matierial.The process conditions were optimazed by quadratic regression orthogonal test method based on single factor experiment.The results showed that the optimum process conditions were as follows：ultrasonic frequency 25 kHz，ratio of material to liquid 1∶26 g·mL-1，extracting time 1.83 h，extraction temperature 56 ℃.The ginkgoic acid extraction efficiency could reach 1.91%.

ultrasonic assistance；quadratic regression orthogonal experiment；ginkgolic acid；extracting technique

10.13428/j.cnki.fjlk.2014.01.020

2013-04-02；

2013-05-06

陜西省教育廳2012年科學(xué)研究項(xiàng)目計(jì)劃(12JK0602)

劉軍海(1972—)，男，陜西渭南人，陜西理工學(xué)院講師，碩士，從事天然產(chǎn)物改性與應(yīng)用化學(xué)品方面的研究。E-mail：iamliujunhai@126.com。

S792.95；S789.7

A

1002-7351(2014)01-0092-05