袁紹鵬++白金葉+章菽+程桂芳+侯琦

[摘要] 目的 研究人工麝香對(duì)卵白蛋白（OVA）致敏引發(fā)的小鼠氣道炎癥損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。 方法 雄性Balb/c小鼠分別于第0天和第14天腹腔注射20 μg OVA和2.25 mg Al（OH）3凝膠致敏，于第28、29、30天從氣管滴入OVA進(jìn)行攻擊，攻擊前1 h給予受試化合物人工麝香及陽(yáng)性藥地塞米松。小鼠隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組（n=11）、模型組（OVA組，n=10）、地塞米松組（Dex組，n=10）、人工麝香給藥10 d組（n=11）、人工麝香給藥7 d組（n=13）、人工麝香給藥5 d組（n=11）。人工麝香皮下給藥100 mg/kg，分別自致敏第21、24、26天開(kāi)始給藥，給藥周期為10、7、5 d。處死小鼠后，對(duì)小鼠的體重、脾臟和胸腺進(jìn)行稱重，計(jì)算脾臟、胸腺指數(shù)。檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液（BALF）炎癥細(xì)胞及炎癥因子IL-4、IL-5及IL-17含量改變，HE染色分析小鼠肺部病理變化，免疫組化分析中性粒細(xì)胞生物標(biāo)志物L(fēng)y6G/Gr-1的表達(dá)水平。 結(jié)果 與模型組相比，人工麝香100 mg/kg連續(xù)給藥5、7 d可改善OVA致敏引發(fā)的小鼠氣道炎癥，明顯降低小鼠BALF炎癥細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-17的含量（P < 0.05）。細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、肺組織病理分析及免疫組化結(jié)果表明，人工麝香能夠抑制小鼠肺部氣道中炎癥細(xì)胞，特別是中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，以及中性粒細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)y6G/Gr-1的表達(dá)。 結(jié)論 人工麝香具有較強(qiáng)的減輕OVA致敏引發(fā)的小鼠氣道炎癥損傷的功能，提示人工麝香對(duì)于哮喘可能有一定的治療作用。

[關(guān)鍵詞] 人工麝香；哮喘；氣道炎癥；中性粒細(xì)胞；白介素17

[中圖分類號(hào)] R285.5[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1673-7210（2014）06（b）-0004-05

Investigation for the effects of artifitial musk on attenuation of OVA-challenged murine airway inflammation

YUAN Shaopeng1 BAI Jinye1 ZHANG Shu2 CHENG Guifang1 HOU Qi1▲

1.Beijing Key Laboratory of New Drug Mechanisms and Pharmacological Evaluation Study, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China; 2.Beijing Lianxin Pharmaceutic Co., Ltd., Beijing 102600, China

[Abstract] Objective To investigate the effects of artifitial musk on attenuation of OVA-challenged murine airway inflammation in vivo and its mechanism. Methods Male Balb/c mice were divided into 6 groups, including control (n=11), OVA model (n=10), Dex (n=10), artifitial musk 10 days (n=11), artifitial musk 7 days (n=13), and artifitial musk 5 days (n=11). Mice were immunized intraperitoneally with 20 μg ovalbumin (OVA) and 4 mg Al(OH)3 suspended in 0.1 mL saline solution on Day 0 and Day 14, and then intratracheally challenged with 1% OVA suspended in saline solution on Days 28-30. Artifitial musk (100 mg/kg, s.c.) was given 1 hour before each OVA challenge for 5, 7 and 10 days since the sensitization for 21, 24, 26 days, respectively. After sacrificed, the body weights, spleen index and thymus index were calculated. In addition, pathologic changes in the lung tissues, number of inflammatory cells in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and expression levels of IL-4, IL-5, IL-17 were observed. Moreover, the expression levels of Ly6G/Gr-1, a major biomarker of neutrophil, was detected by immunohistochemical examination. Results Compared with OVA model, the airway inflammation in mice improved after treatment with 100 mg/kg artifitial musk for 5 and 7 days in vivo. Moreover, the expression levels of major cytokines as IL-4, IL-5 and IL-17 in BALF were inhibited after treatment with musk (P < 0.05). Pathological and cell count results showed that the inflammatory cell especially neutrophile granulocyte infiltration in the airway section reduced after treatment with artifitial musk. Furthermore, immunohistochemical examination results showed that the expression levels of Ly6G/Gr-1 were inhibited upon the treatment. Conclusion The results showed that artifitial musk possesses inhibitory effects on airway inflammation induced with OVA in vivo and the therapeutic function on asthma in the future.

[Key words] Artifitial musk; Asthma; Airway inflammation; Neutrophil; IL-17

哮喘是由氣道慢性炎癥引起的肺部疾病，既往認(rèn)為Ⅰ型輔助性T淋巴細(xì)胞（Th1）與Ⅱ型輔助性T淋巴細(xì)胞（Th2）在數(shù)量、活化及功能方面的失衡是哮喘發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，從而引起Th2型淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等失調(diào)白介素（IL）-4、IL-5、IL-13等Th2型炎癥因子的過(guò)量表達(dá)，最終導(dǎo)致氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性（AHR）的發(fā)生[1-2]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞在哮喘氣道炎癥發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。中性粒細(xì)胞不僅可以導(dǎo)致急性哮喘的惡化，還大量存在于慢性重癥哮喘患者的氣道中。中性粒細(xì)胞具有趨化、吞噬、產(chǎn)生氧自由基及釋放作用等功能。除了重要的防御作用外，中性粒細(xì)胞可以引起感染部位的炎癥，使炎性反應(yīng)進(jìn)一步加重，引起病理性損害。因此，通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞在氣道炎癥微環(huán)境中的過(guò)度表達(dá)，對(duì)治療哮喘，特別是嚴(yán)重性哮喘，將可能發(fā)揮重要的功能[4]。新近研究表明，炎癥因子IL-17在調(diào)控哮喘中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)過(guò)程中發(fā)揮重要的功能，是目前哮喘治療及藥物研發(fā)的新型作用靶點(diǎn)[5-6]。麝香是中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥中極其珍貴的藥品之一，對(duì)心血管、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、內(nèi)分泌及免疫功能均有廣泛的影響[7]。自20世紀(jì)70年代，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所科研人員利用現(xiàn)代藥學(xué)和生物學(xué)理論和技術(shù)，在對(duì)麝香的化學(xué)和藥理學(xué)進(jìn)行了系統(tǒng)深入的研究的基礎(chǔ)上，制備了人工麝香。本課題組既往的研究結(jié)果證明，麝香中水溶性多肽蛋白質(zhì)具有顯著地抑制中性粒細(xì)胞的功能[8]，能夠抑制中性粒細(xì)胞活性脂質(zhì)生成、游離Ca2+水平以及細(xì)胞內(nèi)容物的釋放，從而發(fā)揮抗炎免疫調(diào)節(jié)活性。本文研究人工麝香對(duì)卵白蛋白（OVA）引發(fā)的小鼠氣道炎癥的活性，考察其對(duì)相關(guān)炎癥細(xì)胞因子，如IL-4、IL-5和IL-17等表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Balb/c小鼠，（20±2）g，SPF級(jí)，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供[合格證：SCXK-（京） 2009-0007]。

1.2 藥物與試劑

OVA（美國(guó)Sigma公司），人工麝香（北京聯(lián)馨藥業(yè)有限公司），地塞米松（Sigma公司分裝）。IL-4、IL-5和IL-17 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BioLegend公司。Ly6G/Gr-1抗體購(gòu)自R&D公司。

1.3 動(dòng)物分組及模型建立

小鼠隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組（n=11）、模型組（OVA組，n=10）、地塞米松組（Dex組，n=10）、人工麝香給藥10 d組（n=11）、人工麝香給藥7 d組（n=13）、人工麝香給藥5 d組（n=11）。小鼠分別于第0天和第14天腹腔注射20 μg OVA和2.25 mg Al（OH）3凝膠，第28、29、30天將100 μg OVA溶解在50 μL生理鹽水中，以氣管滴入方式進(jìn)行攻擊，攻擊前1 h給予人工麝香及陽(yáng)性藥地塞米松。

1.4 給藥方式和初始劑量

人工麝香，100 mg/kg劑量皮下給藥，分別自致敏第21、24、26天開(kāi)始給藥，給藥周期為10、7、5 d。陽(yáng)性藥地塞米松，1 mg/kg，灌胃給藥。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 動(dòng)物死亡記錄和稱重動(dòng)物死亡情況隨時(shí)記錄，處死小鼠后，對(duì)小鼠的體重、脾臟和胸腺進(jìn)行稱重，計(jì)算脾臟、胸腺指數(shù)。

1.5.2 支氣管肺泡灌洗液炎癥細(xì)胞及炎癥因子檢測(cè)小鼠在末次激發(fā)后24 h，切開(kāi)頸部皮膚暴露氣管，插入灌流針，用預(yù)冷的PBS 1 mL行肺部灌洗3次，吸出支氣管肺泡灌洗液（BALF）液，4℃離心5 min，細(xì)胞沉淀用PBS緩沖液重懸，以全自動(dòng)血球分析儀進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。上清用ELISA方法分析BALF中IL-4、IL-5、IL-17含量。

1.5.3 小鼠肺部病理分析取出小鼠完整的左側(cè)肺組織，用4%甲醛固定，石蠟包埋，切片后進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察對(duì)比各組小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變。

1.5.4 小鼠肺部免疫組化分析部分小鼠肺組織用4%甲醛固定，石蠟包埋，切片后進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，分析其中中性粒細(xì)胞生物標(biāo)志物L(fēng)y6G/Gr-1的表達(dá)水平。具體步驟為：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；3%過(guò)氧化氫 （H2O2）孵育10 min，去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；微波處理；加入二抗同源的正常血清封閉20 min；加入一抗，置于濕盒4℃ 過(guò)夜；加二抗室溫孵育2 h；加入鏈霉親和素辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物20 min；二氨基聯(lián)苯胺 （DAB）顯色5 min；雙蒸水沖洗，常規(guī)蘇木精復(fù)染、脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。結(jié)果判定：細(xì)胞核清晰、胞質(zhì)有黃色或褐色著色的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物體重、脾臟及胸腺指數(shù)的變化

與模型組相比，給予人工麝香5、7、10 d后，小鼠的胸腺指數(shù)未見(jiàn)顯著變化，但是小鼠脾臟指數(shù)呈現(xiàn)劑量相關(guān)性的增加。各組動(dòng)物體重、脾臟及胸腺指數(shù)的變化見(jiàn)表1。

2.2 支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)

如圖1和表2結(jié)果所示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠BALF中白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯升高（P < 0.05）；與模型組比較，人工麝香100 mg/kg連續(xù)給藥5、7 d可明顯抑制小鼠氣道炎癥細(xì)胞的增加，以及淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的升高（P < 0.05）。但是，人工麝香連續(xù)給藥10 d后，與模型組相比，未見(jiàn)明顯的治療活性（P > 0.05）。因此，本研究后續(xù)重點(diǎn)關(guān)注人工麝香連續(xù)給藥5 d和7 d的情況。

與正常對(duì)照組相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；與模型組相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001

圖1 小鼠支氣管肺泡灌洗液中主要炎癥細(xì)胞分類計(jì)數(shù)

表2 小鼠支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞

及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（104/mL，x±s）

注：與正常對(duì)照組相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；與模型組相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001

2.3 支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子表達(dá)量分析

炎癥因子對(duì)小鼠氣道炎癥細(xì)胞的招募與浸潤(rùn)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了氣道灌洗液中Th2炎癥因子IL-4、IL-5及中性粒細(xì)胞關(guān)鍵調(diào)控因子IL-17的含量。如圖2和表3結(jié)果所示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠BALF液中炎癥因子IL-4、IL-5和IL-17的含量顯著升高（P < 0.01）；與模型組相比，人工麝香治療有效組，即給藥5 d和給藥7 d后，均明顯抑制小鼠氣道炎癥因子的含量（P < 0.01），其中，人工麝香能明顯抑制IL-17蛋白含量（P < 0.001），且活性高于陽(yáng)性藥地塞米松。

與正常對(duì)照組相比，**P < 0.01，***P < 0.001；與模型組相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001

圖2 小鼠支氣管肺泡灌洗液中主要炎癥因子含量

表3 小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子表達(dá)（pg/mL，x±s）

注：與正常對(duì)照組相比，**P < 0.01，***P < 0.001；與模型組相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001；IL-4：白介素4；IL-5：白介素5；IL-17：白介素17

2.4 小鼠肺組織病理分析

小鼠肺部病理結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肺間質(zhì)有大量淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比，人工麝香治療有效組，間質(zhì)散在少量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，提示人工麝香能有效抑制小鼠氣道炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)及侵襲。見(jiàn)圖3。

2.5 免疫組化分析小鼠肺組織Ly6G/Gr-1表達(dá)

小鼠肺部免疫組化分析結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肺部中性粒細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)y6G/Gr-1的表達(dá)明顯升高；與模型組相比，人工麝香治療有效組，Ly6G/Gr-1的表達(dá)被顯著抑制，提示人工麝香能有效抑制小鼠氣道中性粒細(xì)胞的招募以及受體蛋白的表達(dá)。見(jiàn)圖4。

3 討論

麝香作為一種重要的治療非特異性炎癥的藥物，已經(jīng)在臨床上取得一定的效果，其抗炎免疫活性已有相關(guān)報(bào)道。然而盡管有文獻(xiàn)報(bào)道人工麝香在臨床中可用于治療哮喘，特別是對(duì)頑固性慢性哮喘有效，但對(duì)于其相關(guān)作用機(jī)制的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證明，人工麝香具有明顯的抗炎及免疫抑制活性，100 mg/kg連續(xù)給藥5、7 d可有效抑制小鼠氣道炎癥，降低氣道內(nèi)炎癥細(xì)胞及炎癥因子的含量。有意義的是，人工麝香能夠顯著抑制慢性炎癥因子IL-17的表達(dá)以及中性粒細(xì)胞的招募和浸潤(rùn)，這些研究結(jié)果部分解釋了人工麝香治療哮喘，特別是頑固性哮喘的分子機(jī)制。

近年來(lái)，中性粒細(xì)胞在哮喘，特別是頑固性哮喘發(fā)病及進(jìn)展過(guò)程中的活性日益受到關(guān)注[9]。既往認(rèn)為，Th2型淋巴細(xì)胞以及嗜酸性粒細(xì)胞的增加是哮喘發(fā)病的重要原因。但是，臨床研究結(jié)果證明，40%~50%的哮喘患者中Th2型淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等未見(jiàn)顯著變化[10]。尤其是近年來(lái)，針對(duì)IL-5等嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的藥物在臨床治療中未取得預(yù)期療效，進(jìn)一步證明有其他的炎癥細(xì)胞參與了哮喘的發(fā)生及進(jìn)展。越來(lái)越多的研究證明，中性粒細(xì)胞在哮喘的發(fā)生過(guò)程中，特別是嚴(yán)重性哮喘的發(fā)病中發(fā)揮重要的作用。除了重要的防御作用外，中性粒細(xì)胞可以引起感染部位的炎癥，使炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重，引起病理性損害[11]。人工麝香中水溶性多肽蛋白質(zhì)具有顯著的抑制中性粒細(xì)胞的功能。既往研究證明，人工麝香能夠抑制中性粒細(xì)胞活性脂質(zhì)生成、游離Ca2+水平以及細(xì)胞內(nèi)溶物的釋放，從而發(fā)揮抗炎免疫調(diào)節(jié)活性。本研究研究結(jié)果表明，在OVA致敏的小鼠氣道中，有顯著性的中性粒細(xì)胞增加，以及其生物標(biāo)志物L(fēng)y6G/Gr-1含量的升高。這進(jìn)一步證明人工麝香在體內(nèi)可能通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞的招募和浸潤(rùn)，發(fā)揮抗炎免疫調(diào)節(jié)活性。同時(shí)，本研究結(jié)果也證明，通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞在氣道中的侵襲和浸潤(rùn)，對(duì)治療哮喘氣道炎癥，將可能發(fā)揮重要的功能。

IL-17在調(diào)控中性粒細(xì)胞的趨化過(guò)程中發(fā)揮重要的功能。IL-17通過(guò)調(diào)控氣道微環(huán)境中的結(jié)構(gòu)細(xì)胞及炎癥細(xì)胞，促進(jìn)中性粒細(xì)胞趨化及調(diào)控因子的表達(dá)和分泌，從而促進(jìn)中性粒細(xì)胞的招募、黏附及浸潤(rùn)[12]。本研究研究結(jié)果表明，人工麝香能顯著抑制氣道灌洗液中IL-17的表達(dá)含量，其活性甚至強(qiáng)于地塞米松。這一結(jié)果提示，人工麝香可能通過(guò)抑制IL-17的表達(dá)，進(jìn)而影響了氣道內(nèi)中性粒細(xì)胞的招募、黏附等活性，從而抑制中性粒細(xì)胞在氣道內(nèi)的浸潤(rùn)，發(fā)揮治療哮喘氣道炎癥的活性。由于文獻(xiàn)報(bào)道，人工麝香對(duì)頑固性哮喘具有顯著的療效，本研究結(jié)果將有助于解釋人工麝香治療哮喘，特別是頑固性哮喘的分子機(jī)制[6，13]。

本研究也探索了在有效治療劑量下，不同給藥天數(shù)對(duì)小鼠氣道炎癥的抑制活性。有意思的是，人工麝香的治療活性有一定的時(shí)間窗。當(dāng)給藥10 d后，未觀察到顯著的炎癥細(xì)胞抑制活性。由于未進(jìn)行體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究，筆者推測(cè)當(dāng)給藥天數(shù)增加后，可能會(huì)促進(jìn)體內(nèi)拮抗因子或細(xì)胞的增加，從而抵消甚至促進(jìn)機(jī)體的免疫反應(yīng)。因此，未來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，除了檢測(cè)體內(nèi)的藥物代謝時(shí)間及藥物分布外，也需要檢測(cè)相關(guān)抗體等，從而綜合評(píng)價(jià)及指導(dǎo)人工麝香的用藥及治療。

綜合以上研究，本研究初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人工麝香具有顯著的抗炎免疫調(diào)節(jié)活性，能夠抑制小鼠氣道炎癥，炎癥細(xì)胞趨化和浸潤(rùn)以及炎癥因子的表達(dá)。以上結(jié)果，對(duì)于未來(lái)研發(fā)哮喘治療藥物，提供了重要的理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2014-03-16本文編輯：程銘）

[基金項(xiàng)目] 教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（編號(hào)2010 1106120023）。

[作者簡(jiǎn)介] 袁紹鵬（1977.11-），男，博士；研究方向：免疫抑制劑研究。

圖2 小鼠支氣管肺泡灌洗液中主要炎癥因子含量

表3 小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子表達(dá)（pg/mL，x±s）

注：與正常對(duì)照組相比，**P < 0.01，***P < 0.001；與模型組相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001；IL-4：白介素4；IL-5：白介素5；IL-17：白介素17

2.4 小鼠肺組織病理分析

小鼠肺部病理結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肺間質(zhì)有大量淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比，人工麝香治療有效組，間質(zhì)散在少量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，提示人工麝香能有效抑制小鼠氣道炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)及侵襲。見(jiàn)圖3。

2.5 免疫組化分析小鼠肺組織Ly6G/Gr-1表達(dá)

小鼠肺部免疫組化分析結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肺部中性粒細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)y6G/Gr-1的表達(dá)明顯升高；與模型組相比，人工麝香治療有效組，Ly6G/Gr-1的表達(dá)被顯著抑制，提示人工麝香能有效抑制小鼠氣道中性粒細(xì)胞的招募以及受體蛋白的表達(dá)。見(jiàn)圖4。

3 討論

麝香作為一種重要的治療非特異性炎癥的藥物，已經(jīng)在臨床上取得一定的效果，其抗炎免疫活性已有相關(guān)報(bào)道。然而盡管有文獻(xiàn)報(bào)道人工麝香在臨床中可用于治療哮喘，特別是對(duì)頑固性慢性哮喘有效，但對(duì)于其相關(guān)作用機(jī)制的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證明，人工麝香具有明顯的抗炎及免疫抑制活性，100 mg/kg連續(xù)給藥5、7 d可有效抑制小鼠氣道炎癥，降低氣道內(nèi)炎癥細(xì)胞及炎癥因子的含量。有意義的是，人工麝香能夠顯著抑制慢性炎癥因子IL-17的表達(dá)以及中性粒細(xì)胞的招募和浸潤(rùn)，這些研究結(jié)果部分解釋了人工麝香治療哮喘，特別是頑固性哮喘的分子機(jī)制。

近年來(lái)，中性粒細(xì)胞在哮喘，特別是頑固性哮喘發(fā)病及進(jìn)展過(guò)程中的活性日益受到關(guān)注[9]。既往認(rèn)為，Th2型淋巴細(xì)胞以及嗜酸性粒細(xì)胞的增加是哮喘發(fā)病的重要原因。但是，臨床研究結(jié)果證明，40%~50%的哮喘患者中Th2型淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等未見(jiàn)顯著變化[10]。尤其是近年來(lái)，針對(duì)IL-5等嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的藥物在臨床治療中未取得預(yù)期療效，進(jìn)一步證明有其他的炎癥細(xì)胞參與了哮喘的發(fā)生及進(jìn)展。越來(lái)越多的研究證明，中性粒細(xì)胞在哮喘的發(fā)生過(guò)程中，特別是嚴(yán)重性哮喘的發(fā)病中發(fā)揮重要的作用。除了重要的防御作用外，中性粒細(xì)胞可以引起感染部位的炎癥，使炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重，引起病理性損害[11]。人工麝香中水溶性多肽蛋白質(zhì)具有顯著的抑制中性粒細(xì)胞的功能。既往研究證明，人工麝香能夠抑制中性粒細(xì)胞活性脂質(zhì)生成、游離Ca2+水平以及細(xì)胞內(nèi)溶物的釋放，從而發(fā)揮抗炎免疫調(diào)節(jié)活性。本研究研究結(jié)果表明，在OVA致敏的小鼠氣道中，有顯著性的中性粒細(xì)胞增加，以及其生物標(biāo)志物L(fēng)y6G/Gr-1含量的升高。這進(jìn)一步證明人工麝香在體內(nèi)可能通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞的招募和浸潤(rùn)，發(fā)揮抗炎免疫調(diào)節(jié)活性。同時(shí)，本研究結(jié)果也證明，通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞在氣道中的侵襲和浸潤(rùn)，對(duì)治療哮喘氣道炎癥，將可能發(fā)揮重要的功能。

IL-17在調(diào)控中性粒細(xì)胞的趨化過(guò)程中發(fā)揮重要的功能。IL-17通過(guò)調(diào)控氣道微環(huán)境中的結(jié)構(gòu)細(xì)胞及炎癥細(xì)胞，促進(jìn)中性粒細(xì)胞趨化及調(diào)控因子的表達(dá)和分泌，從而促進(jìn)中性粒細(xì)胞的招募、黏附及浸潤(rùn)[12]。本研究研究結(jié)果表明，人工麝香能顯著抑制氣道灌洗液中IL-17的表達(dá)含量，其活性甚至強(qiáng)于地塞米松。這一結(jié)果提示，人工麝香可能通過(guò)抑制IL-17的表達(dá)，進(jìn)而影響了氣道內(nèi)中性粒細(xì)胞的招募、黏附等活性，從而抑制中性粒細(xì)胞在氣道內(nèi)的浸潤(rùn)，發(fā)揮治療哮喘氣道炎癥的活性。由于文獻(xiàn)報(bào)道，人工麝香對(duì)頑固性哮喘具有顯著的療效，本研究結(jié)果將有助于解釋人工麝香治療哮喘，特別是頑固性哮喘的分子機(jī)制[6，13]。

本研究也探索了在有效治療劑量下，不同給藥天數(shù)對(duì)小鼠氣道炎癥的抑制活性。有意思的是，人工麝香的治療活性有一定的時(shí)間窗。當(dāng)給藥10 d后，未觀察到顯著的炎癥細(xì)胞抑制活性。由于未進(jìn)行體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究，筆者推測(cè)當(dāng)給藥天數(shù)增加后，可能會(huì)促進(jìn)體內(nèi)拮抗因子或細(xì)胞的增加，從而抵消甚至促進(jìn)機(jī)體的免疫反應(yīng)。因此，未來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，除了檢測(cè)體內(nèi)的藥物代謝時(shí)間及藥物分布外，也需要檢測(cè)相關(guān)抗體等，從而綜合評(píng)價(jià)及指導(dǎo)人工麝香的用藥及治療。

綜合以上研究，本研究初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人工麝香具有顯著的抗炎免疫調(diào)節(jié)活性，能夠抑制小鼠氣道炎癥，炎癥細(xì)胞趨化和浸潤(rùn)以及炎癥因子的表達(dá)。以上結(jié)果，對(duì)于未來(lái)研發(fā)哮喘治療藥物，提供了重要的理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Wenzel SE. Asthma phenotypes：the evolution from clinical to molecular approaches [J]. Nature Medicine，2012，18：716-725.

[2]Zhu J. Transcriptional regulation of Th2 cell differentiation [J]. Immunology and Cell Biology，2010，88：244-249.

[3]Mantovani A，Cassatella MA，Costantini C，et al. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity [J]. Nature Reviews，2011，11：519-531.

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[6]Park SJ，Lee YC. Interleukin-17 regulation： an attractive therapeutic approach for asthma [J]. Respiratory Research， 2010，11：78.

[7]程桂芳，劉大培，白金葉，等.麝香的藥理研究Ⅳ.麝香對(duì)大鼠炎性滲出液中白細(xì)胞花生四烯酸代謝的影響 [J].中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，1992，14（5）：346-350.

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[9]Nials AT，Uddin S. Mouse models of allergic asthma： acute and chronic allergen challenge [J]. Disease Models & Mechanisms，2008，1：213-220.

[10]Pavord ID. Non-eosinophilic asthma and the innate immune response [J]. Thorax，2007，62：193-194.

[11]Linden A，Laan M，Anderson GP. Neutrophils，interleukin-17A and lung disease [J]. Eur Respir J，2005，25：159-172.

[12]Korn T，Bettelli E，Oukka M，et al. IL-17 and Th17 Cells [J]. Annual Review of Immunology，2009，27：485-517.

[13]Lajoie S，Lewkowich IP，Suzuki Y，et al. Complement-mediated regulation of the IL-17A axis is a central genetic determinant of the severity of experimental allergic asthma [J]. Nature Immunology，2010，11：928-935.

（收稿日期：2014-03-16本文編輯：程銘）

[基金項(xiàng)目] 教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（編號(hào)2010 1106120023）。

[作者簡(jiǎn)介] 袁紹鵬（1977.11-），男，博士；研究方向：免疫抑制劑研究。

圖2 小鼠支氣管肺泡灌洗液中主要炎癥因子含量

表3 小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子表達(dá)（pg/mL，x±s）

注：與正常對(duì)照組相比，**P < 0.01，***P < 0.001；與模型組相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001；IL-4：白介素4；IL-5：白介素5；IL-17：白介素17

2.4 小鼠肺組織病理分析

小鼠肺部病理結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肺間質(zhì)有大量淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比，人工麝香治療有效組，間質(zhì)散在少量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，提示人工麝香能有效抑制小鼠氣道炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)及侵襲。見(jiàn)圖3。

2.5 免疫組化分析小鼠肺組織Ly6G/Gr-1表達(dá)

小鼠肺部免疫組化分析結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肺部中性粒細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)y6G/Gr-1的表達(dá)明顯升高；與模型組相比，人工麝香治療有效組，Ly6G/Gr-1的表達(dá)被顯著抑制，提示人工麝香能有效抑制小鼠氣道中性粒細(xì)胞的招募以及受體蛋白的表達(dá)。見(jiàn)圖4。

3 討論

麝香作為一種重要的治療非特異性炎癥的藥物，已經(jīng)在臨床上取得一定的效果，其抗炎免疫活性已有相關(guān)報(bào)道。然而盡管有文獻(xiàn)報(bào)道人工麝香在臨床中可用于治療哮喘，特別是對(duì)頑固性慢性哮喘有效，但對(duì)于其相關(guān)作用機(jī)制的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證明，人工麝香具有明顯的抗炎及免疫抑制活性，100 mg/kg連續(xù)給藥5、7 d可有效抑制小鼠氣道炎癥，降低氣道內(nèi)炎癥細(xì)胞及炎癥因子的含量。有意義的是，人工麝香能夠顯著抑制慢性炎癥因子IL-17的表達(dá)以及中性粒細(xì)胞的招募和浸潤(rùn)，這些研究結(jié)果部分解釋了人工麝香治療哮喘，特別是頑固性哮喘的分子機(jī)制。

近年來(lái)，中性粒細(xì)胞在哮喘，特別是頑固性哮喘發(fā)病及進(jìn)展過(guò)程中的活性日益受到關(guān)注[9]。既往認(rèn)為，Th2型淋巴細(xì)胞以及嗜酸性粒細(xì)胞的增加是哮喘發(fā)病的重要原因。但是，臨床研究結(jié)果證明，40%~50%的哮喘患者中Th2型淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等未見(jiàn)顯著變化[10]。尤其是近年來(lái)，針對(duì)IL-5等嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的藥物在臨床治療中未取得預(yù)期療效，進(jìn)一步證明有其他的炎癥細(xì)胞參與了哮喘的發(fā)生及進(jìn)展。越來(lái)越多的研究證明，中性粒細(xì)胞在哮喘的發(fā)生過(guò)程中，特別是嚴(yán)重性哮喘的發(fā)病中發(fā)揮重要的作用。除了重要的防御作用外，中性粒細(xì)胞可以引起感染部位的炎癥，使炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重，引起病理性損害[11]。人工麝香中水溶性多肽蛋白質(zhì)具有顯著的抑制中性粒細(xì)胞的功能。既往研究證明，人工麝香能夠抑制中性粒細(xì)胞活性脂質(zhì)生成、游離Ca2+水平以及細(xì)胞內(nèi)溶物的釋放，從而發(fā)揮抗炎免疫調(diào)節(jié)活性。本研究研究結(jié)果表明，在OVA致敏的小鼠氣道中，有顯著性的中性粒細(xì)胞增加，以及其生物標(biāo)志物L(fēng)y6G/Gr-1含量的升高。這進(jìn)一步證明人工麝香在體內(nèi)可能通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞的招募和浸潤(rùn)，發(fā)揮抗炎免疫調(diào)節(jié)活性。同時(shí)，本研究結(jié)果也證明，通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞在氣道中的侵襲和浸潤(rùn)，對(duì)治療哮喘氣道炎癥，將可能發(fā)揮重要的功能。

IL-17在調(diào)控中性粒細(xì)胞的趨化過(guò)程中發(fā)揮重要的功能。IL-17通過(guò)調(diào)控氣道微環(huán)境中的結(jié)構(gòu)細(xì)胞及炎癥細(xì)胞，促進(jìn)中性粒細(xì)胞趨化及調(diào)控因子的表達(dá)和分泌，從而促進(jìn)中性粒細(xì)胞的招募、黏附及浸潤(rùn)[12]。本研究研究結(jié)果表明，人工麝香能顯著抑制氣道灌洗液中IL-17的表達(dá)含量，其活性甚至強(qiáng)于地塞米松。這一結(jié)果提示，人工麝香可能通過(guò)抑制IL-17的表達(dá)，進(jìn)而影響了氣道內(nèi)中性粒細(xì)胞的招募、黏附等活性，從而抑制中性粒細(xì)胞在氣道內(nèi)的浸潤(rùn)，發(fā)揮治療哮喘氣道炎癥的活性。由于文獻(xiàn)報(bào)道，人工麝香對(duì)頑固性哮喘具有顯著的療效，本研究結(jié)果將有助于解釋人工麝香治療哮喘，特別是頑固性哮喘的分子機(jī)制[6，13]。

本研究也探索了在有效治療劑量下，不同給藥天數(shù)對(duì)小鼠氣道炎癥的抑制活性。有意思的是，人工麝香的治療活性有一定的時(shí)間窗。當(dāng)給藥10 d后，未觀察到顯著的炎癥細(xì)胞抑制活性。由于未進(jìn)行體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究，筆者推測(cè)當(dāng)給藥天數(shù)增加后，可能會(huì)促進(jìn)體內(nèi)拮抗因子或細(xì)胞的增加，從而抵消甚至促進(jìn)機(jī)體的免疫反應(yīng)。因此，未來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，除了檢測(cè)體內(nèi)的藥物代謝時(shí)間及藥物分布外，也需要檢測(cè)相關(guān)抗體等，從而綜合評(píng)價(jià)及指導(dǎo)人工麝香的用藥及治療。

綜合以上研究，本研究初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人工麝香具有顯著的抗炎免疫調(diào)節(jié)活性，能夠抑制小鼠氣道炎癥，炎癥細(xì)胞趨化和浸潤(rùn)以及炎癥因子的表達(dá)。以上結(jié)果，對(duì)于未來(lái)研發(fā)哮喘治療藥物，提供了重要的理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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[6]Park SJ，Lee YC. Interleukin-17 regulation： an attractive therapeutic approach for asthma [J]. Respiratory Research， 2010，11：78.

[7]程桂芳，劉大培，白金葉，等.麝香的藥理研究Ⅳ.麝香對(duì)大鼠炎性滲出液中白細(xì)胞花生四烯酸代謝的影響 [J].中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，1992，14（5）：346-350.

[8]王文杰，白金葉，程桂芳，等.麝香糖蛋白成分對(duì)白三烯B4激活的大鼠中性白細(xì)胞功能的影響[J].中國(guó)中藥雜志，1998，23（4）：46-48，65.

[9]Nials AT，Uddin S. Mouse models of allergic asthma： acute and chronic allergen challenge [J]. Disease Models & Mechanisms，2008，1：213-220.

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[11]Linden A，Laan M，Anderson GP. Neutrophils，interleukin-17A and lung disease [J]. Eur Respir J，2005，25：159-172.

[12]Korn T，Bettelli E，Oukka M，et al. IL-17 and Th17 Cells [J]. Annual Review of Immunology，2009，27：485-517.

[13]Lajoie S，Lewkowich IP，Suzuki Y，et al. Complement-mediated regulation of the IL-17A axis is a central genetic determinant of the severity of experimental allergic asthma [J]. Nature Immunology，2010，11：928-935.

（收稿日期：2014-03-16本文編輯：程銘）

[基金項(xiàng)目] 教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（編號(hào)2010 1106120023）。

[作者簡(jiǎn)介] 袁紹鵬（1977.11-），男，博士；研究方向：免疫抑制劑研究。