丁超，陸啟濱

（1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學附屬江蘇省中醫(yī)院 婦科，江蘇 南京 210029）

安子合劑對抗心磷脂抗體陽性流產(chǎn)小鼠母胎界面ERK1／2信號通路的影響

丁超1，陸啟濱2Δ

（1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學附屬江蘇省中醫(yī)院 婦科，江蘇 南京 210029）

目的研究細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）1／2信號通路參與抗心磷脂抗體（anticardiolipin antibodies，ACA）陽性流產(chǎn)的發(fā)病過程，從細胞增殖的角度闡明安子合劑對ERK1／2信號通路的影響。方法采用免疫組化方法檢測ACA陽性流產(chǎn)模型組、空白對照組、安子合劑低／中／高劑量組和阿司匹林組小鼠母胎界面ERK1、ERK2磷酸化水平。結果JD801形態(tài)學統(tǒng)計分析結果顯示安子合劑低劑量組ERK1平均光密度值（0.678±0.097）接近空白對照組的平均光密度值（0.727±0.047），差異無統(tǒng)計學意義；模型組、安子合劑中劑量組、高劑量組、阿司匹林組ERK1平均光密度值（0.434±0.066、0.613±0.041、0.487±0.061、0.551±0.056）均較空白對照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。模型組、安子合劑低劑量組、中劑量組、高劑量組、阿司匹林組 ERK2平均光密度值（0.430±0.058、0.621±0.041、0.562±0.047、0.449±0.062、0.515±0.045）均較空白對照組（0.708±0.038）明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結論安子合劑可以通過ERK信號轉導通路提高細胞增殖的活性，改善胎盤功能，改變?nèi)焉锝Y局。

抗心磷脂抗體；細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1／2；流產(chǎn)；母胎界面；安子合劑

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級BALB／c雌性、雄性小鼠各25只，8周齡，體質(zhì)量（25±2）g，購自揚州大學比較醫(yī)學中心，許可證號：SCXK（蘇）2009—0001。雌性小鼠隨機分為模型組4只、空白對照組4只、安子合劑低劑量組5只、中劑量組5只、高劑量組4只、阿司匹林組3只。其中安子合劑低／中／高劑量分別相當于成人劑量的1倍、2倍、4倍。

1.2 實驗試劑與儀器 p-ERK1抗體、p-ERK2抗體，由bioworlde公司提供；通用型二抗試劑盒（PV-6000）、DAB顯色劑（ZLI-9018），由北京中杉提供。RM2135切片機（德國 Leica），YB-7B石蠟包埋機（湖北孝感亞光）。

1.3 實驗用藥 安子合劑（由江蘇省中醫(yī)院提供，蘇藥制字 Z04000568，產(chǎn)品批號：100419，250mL／瓶）主要成分為：川斷、桑寄生、菟絲子、杜仲、太子參、白術、苧麻根、黃芩、丹參等。分別濃縮成安子合劑高、中、低劑量，相當于生藥含量的7.54 g／m L、3.77 g／mL、1.885 g／mL。阿司匹林（石藥集團歐意藥業(yè)有限公司，國藥準字H13023635）為腸溶片，取75mg溶于76.9 mL蒸餾水中，配成0.975mg／mL的溶液。

1.4 給藥方法 模型組：妊娠第1天給予蒸餾水灌胃，0.1mL／10 g，1次／日，連續(xù)14 d；空白對照組：妊娠第1天給予蒸餾水灌胃，0.1mL／10 g，1次／日，連續(xù)14 d；安子合劑低劑量組：妊娠第1天給予濃縮后的小劑量安子合劑灌胃，37.7mg／（g·d），0.1mL／10 g，1次／日，連續(xù)14 d；安子合劑中劑量組：妊娠第1天給予濃縮后的中劑量安子合劑灌胃，75.4mg／（g·d），0.1mL／10 g，1次／日，連續(xù)14 d；安子合劑高劑量組：妊娠第1天給予濃縮后的大劑量安子合劑灌胃，150.8 mg／（g·d），0.1 mL／10 g，1次／日，連續(xù)14 d；阿司匹林組：妊娠第1天給予溶解后的阿司匹林灌胃，0.0195mg／（g·d），0.1mL／10 g，1次／日，連續(xù) 14 d。

1.5 實驗方法 參照文獻［8］，取人β2-GPⅠ溶于無菌PBS中，調(diào)整濃度為100 ug／0.25mL，模型組、安子合劑低／中／高劑量組、阿司匹林組第1天注射人β2GP-1溶液與CFA（1∶1比例）混合液50 uL，空白對照組注射生理鹽水50 uL；第8天以IFA代替CFA加強免疫1次；至第18天各組雌性小鼠與雄性小鼠1∶1合籠，自合籠之日起，每天按8∶00和14∶00分別觀察一次，以見到陰栓為妊娠第0天。在妊娠第15天上午8時處死各組孕鼠，取子宮、胎盤。取胎盤、子宮組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋用于常規(guī)組織病理切片及免疫組化檢測ERK1和ERK2磷酸化水平。

1.5 實驗步驟 HE染色；免疫組化：采用二步法免疫組化檢測試劑：（①脫蠟、水化組織切片；②根據(jù)所應用的一抗的特殊要求，對組織切片進行預處理；③3%H2O2去離子水孵育5min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS或TBS沖洗；④滴加一抗，室溫或37℃孵育30～60min，PBS或TBS沖洗3次，每次2min；⑤滴加通用型IgG抗體（Fab段）-HRP多聚體，室溫或37℃孵育10～20min，PBS或TBS沖洗3次，每次2min；⑥應用DAB溶液顯色；⑦蒸餾水沖洗、復染、脫水、封片。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0分析數(shù)據(jù)，正態(tài)計量資料以（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組孕鼠ERK1磷酸化水平比較 安子合劑低劑量組ERK1磷酸化水平與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義；與空白對照組相比，模型組、安子合劑中劑量組、高劑量組、阿司匹林組ERK1磷酸化水平均明顯降低，比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組相比，空白對照組、安子合劑低劑量組、中劑量組ERK1磷酸化水平明顯提高，比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；阿司匹林組ERK1磷酸化水平高于模型組（P＜0.05）。模型組與安子合劑高劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義（見表1、圖1）。

表1 各組孕鼠ERK1磷酸化水平比較Tab.1 Comparision of ERK1 phosphorylation level in each group

2.2 各組孕鼠ERK2磷酸化水平比較 與空白對照組相比，模型組、安子合劑低劑量組、中劑量組、高劑量組、阿司匹林組ERK2磷酸化水平均明顯降低，比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組相比，空白對照組、安子合劑低劑量組、中劑量組ERK2磷酸化水平明顯提高，比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；阿司匹林組ERK2磷酸化水平高于模型組（P＜0.05）。模型組與安子合劑高劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義（見表2）。

表2 各組孕鼠ERK2磷酸化水平比較Tab.2 Comparision of ERK2 phosphorylation level in each group

2.3 各組小鼠子宮蛻膜和絨毛組織細胞胞漿中ERK1、ERK2磷酸化水平病理結果分析 各組小鼠子宮蛻膜和絨毛組織細胞胞漿中ERK1、ERK2磷酸化水平病理結果均顯示為：模型組在子宮蛻膜和絨毛組織胞漿中基本無表達；安子合劑低劑量組：子宮蛻膜和絨毛組織胞漿中呈彌漫性中高度表達，見大量表達物呈棕褐色竄珠狀，表達水平接近于空白對照組；空白對照組：子宮蛻膜和絨毛組織胞漿中呈彌漫性高度表達，表達物呈棕褐色竄珠狀；安子合劑中劑量組：子宮蛻膜和絨毛組織胞漿中呈彌漫性中度表達，見大部分表達物呈棕褐色竄珠狀，表達水平低于安子合劑低劑量組，高于模型組及安子合劑高劑量組、阿司匹林組；安子合劑高劑量組：子宮蛻膜和絨毛組織胞漿中呈分散性低度表達，見極少量表達物呈棕褐色竄珠狀，或未見表達物；阿司匹林組：子宮蛻膜和絨毛組織胞漿中呈彌漫性低度表達，見少量表達物呈棕褐色竄珠狀，表達水平高于模型組、安子合劑高劑量組（見圖1、圖2）。

圖1 各組母胎界面ERK1磷酸化水平（×400）Fig.1 Comparision of ERK1 phosphorylation level in maternal-fetal interface of each group（×400）

圖2 各組母胎界面ERK2磷酸化水平（×400）Fig.2 Comparision of Raf1 phosphorylation level in maternal-fetal interface of each group（×400）

3 討論

中醫(yī)認為，發(fā)生免疫性流產(chǎn)其基本的病機為機體脾腎兩虛、胎元不固［9］。安子合劑其方中川斷、菟絲子以及桑寄生有補腎養(yǎng)血、固攝安胎之作用；苧麻根則可止血安胎、清熱涼血、滋陰益腎；黃芩可清心肝之火，同時寧心安神；運用黃芩配伍白術，為歷代安胎之圣藥，具有清熱安胎之功；太子參與白術相配伍，則可健脾腎而安胎；當歸、丹參養(yǎng)血和血，疏通機體脈絡，調(diào)暢機體胞宮氣血，從而養(yǎng)胎元［10-11］。以上諸藥合用，可標本兼顧，發(fā)揮滋陰清熱、益腎安胎之功效。本研究中，選用阿司匹林作為陽性藥物，阿司匹林在臨床上可用于治療ACA陽性的一種抗凝藥物，因此相當于中醫(yī)當中的活血化瘀藥物，可作為治標之劑［12］。

ERK1／2的過度活化能夠促使細胞周期的遞進和細胞增殖，在滋養(yǎng)細胞的增殖分化及侵襲過程中發(fā)揮重要作用［13-14］。大量研究證明，ERK1／2與細胞的增殖、分化和血小板生成密切相關［15-17］。只有磷酸化的 ERKl／2才具有活性，由于 ERKl／2活性的降低，導致細胞增殖活力降低，胎盤功能減退，血流灌注不行，引發(fā)血栓，胚胎著床后出現(xiàn)早期死亡，實驗通過ACA對ERK1／2活性的影響，證明ACA可完全抑制滋養(yǎng)層細胞的增殖，安子合劑能有效上調(diào)中劑量組和阿司匹林組母胎界面上ERK1、ERK2的磷酸化水平，顯著上調(diào)低劑量組母胎界面上ERK1、ERK2的磷酸化水平，也進一步從細胞增殖的角度說明安子合劑能夠通過ERK信號通路這一轉導途徑提高滋養(yǎng)細胞增殖的活力，改善胎盤功能，改變?nèi)焉锝Y局。

經(jīng)臨床證實，安子合劑具有著顯著的臨床療效［18］，而本研究證實安子合劑能夠通過ERK信號通路從而改善胎盤功能以及妊娠結局，揭示安子合劑保胎作用的分子機制，從而為其臨床治療奠定基礎。但是否還有其他作用機制仍然需要進一步研究證實，并且由于研究時間和經(jīng)費的局限，本課題研究還存在許多不足之處，未能進行體外培養(yǎng)ACA陽性流產(chǎn)患者的絨毛滋養(yǎng)細胞，今后將繼續(xù)完善實驗內(nèi)容，將整體實驗與離體實驗相結合，對ACA陽性妊娠丟失動物模型母胎界面上組織超微結構進一步研究。

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（編校：吳茜）

Impact of Anziheji against ERK1／2 signaling pathways on the maternal-fetal interface of ACA positive abortion in m ice

DING Chao1，LU Qi-bin2Δ
（1.Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210029，China；2.Chinese Medicine Hospital of Jiangsu Province，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo study the role of ERK1／2 signaling pathways on the process of ACA positive abortion and explore the effect of Anziheji on ERK1／2 signaling pathways from cell proliferation.MethodsLevels of ERK1／2 on maternal-fetal interface of every mice in ACA positive abortion model group，blank control group，Anziheji low，mediate，high dose group，aspirin group were detected by immunohistochemical.ResultsThe average optical density value of ERK1 in Anziheji low dose group（0.678±0.097）was close to normal group（0.727±0.047），therewas no significant difference between them.Compared with blank controlgroup，the ERK1 average optical density value inmodelgroup（0.434±0.066），Anzihejidose group（0.613±0.041），high dose group（0.487±0.061）and aspirin group（0.551±0.056）were significantly lower，and the differences were all statistically significant（P＜0.01）.Compared with blank control group（0.708±0.038），the ERK2 average optical density values inmodel group（0.430±0.058），Anziheji low dose group（0.621±0.041），mediate dose group（0.562±0.047），high dose group（0.449±0.062）and aspirin group（0.515±0.045）were significantly lower，and the differences were all statistically significant（P＜0.01）.ConclusionAnziheji can improve the activity of cell proliferation，improve the function of the placenta and change the outcome of pregnancy through ERK signal pathway.

anticardiolipin antibodies；ERK1／2；abortion；maternal-fetal interface；Anziheji

R711.59

A

1005-1678（2014）03-0040-04

反復自然流產(chǎn)在育齡夫妻中的發(fā)病率為2%～5%，發(fā)病原因較為復雜，主要涉及到內(nèi)分泌、遺傳、免疫、代謝、感染等多個方面，大概80%以上的反復自然流產(chǎn)（repeated spontaneous abortion，RSA）是由免疫因素造成的［1-2］，其中抗心磷脂抗體（anticardiolipin antibodies，ACA）陽性流產(chǎn)占較高的比例。在研究免疫性先兆流產(chǎn)的過程中，陸啟濱［3］根據(jù)ACA陽性流產(chǎn)“脾腎兩虛，血熱夾瘀”的病因病機創(chuàng)立了安子合劑，安子合劑能夠明顯提高細胞增殖活力，降低小鼠血清ACA滴度，對血管內(nèi)皮細胞損傷具有良好的保護和修復作用，顯著降低胚胎丟失率。研究發(fā)現(xiàn)細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）信號通路與早期妊娠滋養(yǎng)細胞的侵襲相關，調(diào)節(jié)包括滋養(yǎng)干細胞在內(nèi)的細胞增殖、分化與凋亡等多種生物學功能［4-6］。ERK突變的胚胎外胚層及胎盤錐形成不良，胚胎著床后出現(xiàn)早期死亡，轉入正常ERK基因可拯救突變小鼠胎盤的異常發(fā)育［7］，提示ERK對滋養(yǎng)細胞的功能及妊娠的正常維持至關重要。據(jù)此我們考慮ERK1／2信號傳導通路可能參與了ACA陽性流產(chǎn)的發(fā)生發(fā)展過程，本實驗旨在從細胞增殖的角度闡明安子合劑的作用機制。

江蘇省中醫(yī)藥領軍人才培養(yǎng)計劃（CJ200910）

丁超，女，博士在讀，研究方向：流產(chǎn)類疾病，E-mail：dc19860923＠163.com；陸啟濱，通信作者，女，教授、博士生導師、主任醫(yī)師，研究方向：婦科疾病，E-mail：wenwd＠nuaa.edu.cn。