孫婷婷 鄒 莉

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

許繼飛

(內(nèi)蒙古大學)

于 洋

(東北林業(yè)大學)

歐美楊 108(Populus euramericana“114/690”)引種于意大利，為美洲黑楊與歐洲黑楊的人工雜種無性系，該品種在耐旱性、耐寒性、生長速度、抗病蟲害能力及成材質(zhì)量等方面都非常優(yōu)越，被列為我國華北和西北重點推廣樹種。但是，隨著歐美楊的廣泛栽培，病蟲害的發(fā)生越來越嚴重，因此，其抗性育種顯得尤為迫切。采用基因工程技術開展轉基因楊樹的研究，是培育抗逆、抗蟲和抗病楊樹新品種的有效途徑[1]。天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是從葫蘆科藥用植物栝樓(Trichosanthes kirilowii Maxim)塊根中分離得到的單鏈核糖體失活蛋白(Ribosome Inactivating Protein，RIP)，近年來的研究結果表明，天花粉蛋白和植物的防御反應相關，它對真菌、病毒和昆蟲有直接或間接的抑制和殺滅作用[2]。利用基因工程手段，將具有抗病和抗蟲特性的天花粉蛋白基因轉入歐美楊108，增強其抗逆性，使歐美楊108免遭病蟲危害，具有無污染，不殺傷天敵，保護生物多樣性，維持生態(tài)平衡等特點，且意義重大。

目前，闊葉樹種主要采用根癌農(nóng)桿菌介導進行遺傳轉化[3]。本研究以歐美楊108無菌苗為材料，采用農(nóng)桿菌介導法，進行抗病蟲天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)基因的遺傳轉化研究。抗性體經(jīng)PCR和PCR－Southern檢測，初步證實TCS基因已經(jīng)整合到歐美楊108的基因組中。

1 材料與方法

植物材料:歐美楊 108(Populus euramericana“114/690”)組培苗由林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學)提供。

菌株和質(zhì)粒:宿主菌 Escherichia coli DH5α，Agrobacterium tumefeciens LBA4404均為北京大學保藏菌種。pT1－3為北京大學構建含有TCS啟動子及結構基因(提取自葫蘆科藥用植物栝樓(Trichosanthes kirilowii Maxim)塊根中)的質(zhì)粒，其中啟動子大小約為 1140 bp，結構基因大小約為 760 bp。pCambia1301為北京大學保藏的質(zhì)粒。pUCm－T質(zhì)粒載體購自上海生工公司。

試劑:各種限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA片段和PCR產(chǎn)物回收試劑盒為Promega公司產(chǎn)品;T4 DNA連接酶和 λDNA/HindⅢ+EcoRⅠMarker為華美生物工程公司產(chǎn)品;Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司，其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。引物合成和測序由上海生工公司完成。

培養(yǎng)基:分化培養(yǎng)基，MS+0.5 mg·L－16－BA+0.1 mg·L－1NAA;預培養(yǎng)基，MS+0.5 mg·L－16－BA+0.1 mg·L－1NAA;共培養(yǎng)基，MS+0.5 mg·L－16－BA+0.1 mg·L－1NAA+200 μmol·L－1AS(乙酰丁香酮);預篩選培養(yǎng)基，MS+0.5 mg·L－16－BA+0.1 mg·L－1NAA+400 mg·L－1Carb(羧卞青霉素);篩選培養(yǎng)基，MS+0.5mg·L－16－BA+0.1mg·L－1NAA+0.2mg·L－1Hyg(潮霉素)+400 mg·L－1Carb(羧卞青霉素);生根培養(yǎng)基，WPM(木本植物用培養(yǎng)基)+0.4 mg·L－1IBA+0.1 mg·L－1Hyg(潮霉素)+600 mg·L－1Cefo(頭孢噻肟鈉)。

植物表達載體構建:用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和BamHⅠ雙酶切質(zhì)粒pT1－3得到TCS啟動子及結構基因，再回收目的片段;同樣使用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和BamHⅠ雙酶切質(zhì)粒pCambia1301后得到載體片段并將其回收，將兩者用T4 DNA連接酶16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。經(jīng)PCR鑒定的陽性菌液，提取質(zhì)粒，進行SacⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定和雙向測序。鑒定正確的質(zhì)粒命名為 pC－tPro－TCS[4]。

農(nóng)桿菌介導轉化歐美楊108:將構建好的植物表達載體用液氨凍融法導入農(nóng)桿菌中。采用葉盤法轉化歐美楊108，從平板上挑取經(jīng)PCR驗證的陽性單菌落放入5 mL含有相應抗生素(50 mg·L－1Rif、40 mg·L－1Strep、50 mg·L－1Kan)的 LB 液體培養(yǎng)基中，28℃，190 rpm振蕩培養(yǎng)過夜;取1 mL菌液加入20 mL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)6～8 h，在無菌條件下用無菌水稀釋菌液至OD600(光密度)為0.4左右;在無菌條件下，取生長良好的無菌苗葉片，將葉片橫斜切成2～3段，葉背向下在黑暗條件下預培養(yǎng)2 d;放入農(nóng)桿菌侵染液中侵染15 min，在這一過程中輕輕振蕩，取出葉片段，用無菌濾紙吸干;將葉片轉入共培養(yǎng)基中于培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)2d[5]。葉片枯化后進行數(shù)據(jù)記錄，數(shù)據(jù)用 SPSS和DPS軟件分析。

轉化效率=(形成抗性芽(或抗性愈傷)的葉片數(shù)/總的葉片數(shù))×100%。

抗性植株的分子生物學檢測:抗性植株的PCR擴增檢測。采用CTAB法[6]提取植物材料總DNA。以質(zhì)粒DNA作為陽性對照，以未轉化的歐美楊108 DNA作為陰性對照，抗性苗進行PCR檢測，根據(jù)TCS結構基因設計引物為 5'－GGGAAGCTTTGCCATATTGTTTCGATTC－3'和 5'－GGGCATATGGATGTTAGCTTCCGGTTA－3';PCR反應的總體積 25 μL，PCR反應條件為94℃預變性4 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸 1 min，30 個循環(huán)，再72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

抗性植株的PCR－Southern雜交:采用地高辛標定的探針進行分子雜交。分子雜交試劑盒為DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ，Cat.No.11745832910。將 PCR 擴增產(chǎn)物電泳后印跡于硝酸纖維素膜上，以陽性質(zhì)粒擴增回收產(chǎn)物為模板合成探針，進行PCR－Southern雜交檢測。

2 結果與分析

2.1 植物表達載體pC－tPro－TCS鑒定

質(zhì)粒pCambia 1301為11.8 kb，在多克隆位點上有SacⅠ和BamHⅠ酶切位點，SacⅠ和BamHⅠ之間有10 bp。質(zhì)粒pT1－3的SacⅠ與BamHⅠ位點之間約為96 bp，TCS啟動子及結構基因長為1.9 kb，所以構建的重組質(zhì)粒 pC－tPro－TCS大小約為13.7 kb。提取重組質(zhì)粒pC－tPro－TCS，進行KpnⅠ和BglⅡ雙酶切鑒定，得到約2.0 kb和11.7 kb兩個片段，所得酶切產(chǎn)物片段大小與預期相符。此外，雙向測序結果也表明，克隆的TCS啟動子及結構基因序列是正確的。

2.2 植物表達載體轉化農(nóng)桿菌

將構建好的植物表達載體經(jīng)凍融法轉化農(nóng)桿菌LBA4404，在附加卡那霉素、利福平和鏈霉素的LB培養(yǎng)基上篩選。挑取陽性克隆，一部分搖菌、提取質(zhì)粒進行PCR擴增，另一部分進行菌落直接PCR鑒定，兩者均特異的擴增出約760 bp大小的TCS結構基因;除此之外，提取質(zhì)粒進行KpnⅠ和BglⅡ雙酶切鑒定，所得酶切產(chǎn)物大小與預期相符，結果表明，已成功地將含有天花粉蛋白(TCS)基因的pC－tPro－TCS植物表達載體導入了根癌農(nóng)桿菌LBA4404。

2.3 歐美楊108轉化抗性再生植株的獲得

歐美楊108葉片經(jīng)農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng)后，在含有2 mg·L－1Hyg(潮霉素)的篩選培養(yǎng)基中進行篩選，2個月后，移入生根培養(yǎng)基中誘導生根，獲得再生植株(圖1、圖2)。本研究轉化420個外植體，共獲得18個抗性愈傷和抗性芽，轉化效率為4.3%。

2.4 抗性植株的PCR擴增檢測

取抗性植株基因組DNA做模板，以農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA作為陽性對照，以未轉化植株為陰性對照，用TCS結構基因的特異性引物進行PCR擴增。結果如圖3所示，未轉化植株的基因組未出現(xiàn)PCR特異擴增片斷，抗性植株與質(zhì)粒DNA的擴增條帶相同，大小均為760 bp。因此，初步證明了目的基因TCS已經(jīng)整合到受體歐美楊108的基因組中。

圖1 選擇培養(yǎng)基上抗性芽的獲得

圖2 轉基因苗

圖3 Hyg抗性再生植株的PCR檢測電泳分析

2.5 抗性植株的PCR－Southern雜交

為了進一步證明PCR擴增產(chǎn)物是目的基因片段，將PCR擴增產(chǎn)物電泳后印跡于硝酸纖維素膜上，以陽性質(zhì)粒擴增回收產(chǎn)物為模板合成探針，進行PCR－Southern雜交檢測，結果表明，轉入TCS基因植株和對照一樣，均顯示出較強的雜交信號。結果見圖4。在檢測過的4個抗性植株中，全部呈陽性。進一步證明了TCS基因已整合到了歐美楊108基因組中。

圖4 Hyg抗性再生植株的PCR－Southern檢測

3 結束語

近年來，天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)基因被轉入不同植物中，徐瓊芳等[7]將天花粉蛋白基因導入小麥中，發(fā)現(xiàn)轉天花粉蛋白基因的小麥對黃矮病的抗性得到顯著提高。Yan et al.[8]、Ming et al.[9]將天花粉蛋白基因與35S啟動子融合，通過改進的基因槍技術，轉入到Zhonghua 8中，獲得了天花粉蛋白穩(wěn)定表達的陽性植株，同時，還發(fā)現(xiàn)天花粉蛋白作為外源基因的引入并沒有對水稻的生長發(fā)育產(chǎn)生影響。周長梅[10]采用根癌農(nóng)桿菌介導法首次將天花粉蛋白基因導入木本植物葡萄中，并獲得了PCR陽性植株。2011年劉靜等[11]將 TCS基因轉化泡桐，通過抗性試驗表明，轉TCS基因泡桐對叢枝病具有一定的抗性。到目前為止，還未見有利用農(nóng)桿菌介導法將TCS基因轉入歐美楊108的研究報道。

本研究構建了含有TCS啟動子和結構基因的植物表達載體，對構建的植物表達載體pC－tPro－TCS的鑒定時，采用的是KpnⅠ和BglⅡ雙酶切，而不是SacⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，KpnⅠ和BglⅡ分別位于SacⅠ的上游和BamHⅠ的下游，這樣酶切和測序的結果更為準確。將構建好的植物表達載體通過農(nóng)桿菌介導法成功導入歐美楊108植株中，抗性體經(jīng)PCR和PCR－Southern檢測可以初步證實外源基因整合到基因組中[12－14]，而對于TCS基因是否真正整合到歐美楊108的基因組中則需要進一步試驗，例如是否有報告基因蛋白表達的染色等[15]。

[1]閆新甫.轉基因植物[M].2 版.北京:科學出版社，2003:426.

[2]汪猷.天花粉蛋白[M].北京:科學出版社，1990.

[3]姜金仲，李云，薛諾穩(wěn)，等.林木遺傳轉化及其潛在生態(tài)風險研究進展[J].西北林學院學報，2012，27(1):103－108，123.

[4]鄒莉.天花粉蛋白基因表達載體的構建及轉化楊樹的研究[D].哈爾濱:東北林業(yè)大學，2005.

[5]許繼飛.歐美楊108再生體系的優(yōu)化及轉天花粉蛋白基因的研究[D].哈爾濱:東北林業(yè)大學，2006.

[6]Mccouch S R，Chen X，Panaud O，et al.Microsatellite marker development，mapping and applications in rice genetics and breeding[J].Plant Molecular Biology，1997，35(1/2):89－99.

[7]徐瓊芳，李連城，馬有志，等.用天花粉蛋白基因轉化小麥獲得轉基因植株[J].遺傳，2001，23(2):135－137.

[8]Yan Yuanxin，An Chengcai，Li Li，et al.The sense and antisense expression of gibberellin 20-oxidase gene(rga5)in rice and its effects on GA1 level and agronomic traits[J].Chinese Science Bulletin，2003，48(5):443－448.

[9]Ming Xiaotian，Yuan Huayi，Wang Lijiang，et al.Agrobacteriummediated transformation of rice with help of bombardment[J].Acta Botanica Sinica，2001，43(1):72－76.

[10]周長梅.農(nóng)桿菌介導法將天花粉蛋白基因導入葡萄的研究[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學，2002.

[11]劉靜，黃艷艷，翁曼麗，等.TCS基因轉化泡桐及抗病能力[J].林業(yè)科學，2011，47(5):171－176.

[12]張書利，劉麗君，唐曉飛，等.利用農(nóng)桿菌介導法將BrCS基因導入大豆的研究[J].大豆科學，2011，30(4):569－573.

[13]金華，尚敏克，姜國斌.導入抗逆基因的轉雙抗蟲基因741楊的獲得[J].東北林業(yè)大學學報，2012，40(1):28－31.

[14]徐書舉，楊曉欽，張仁和，等.不同玉米自交系中導入SAMS基因的轉化與檢測[J].西北農(nóng)業(yè)學報，2012，21(3):59－62.

[15]梁海永，劉興菊，蘇彥蘋，等.RolB基因對三倍體毛白楊的轉化研究[J].西北林學院學報，2011，26(2):86－90.