張夢(mèng)瑩 趙玉娟 李倩竹 沈明浩

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春，130118)

鹿茸為鹿科動(dòng)物梅花鹿(Cervus nippon Temminck)或馬鹿(Cervus elaphus Temminck)的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1]。作為一種名貴中藥材，鹿茸已有2000多年入藥歷史[2]，具有保護(hù)心血管系統(tǒng)、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗氧化、強(qiáng)壯中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗腫瘤、改善高脂血癥等多種作用功效。眾多試驗(yàn)研究表明，多肽、蛋白質(zhì)是鹿茸中的主要有效成分，目前在該成分的提取工藝研究方面，多以水[3]、乙醇[4]、醋酸鹽緩沖溶液[5]、磷酸鹽緩沖溶液[6]和 Tris－HCl緩沖溶液[7]為提取溶劑，偏重酸性及中性環(huán)境;提取方式雖已由常見(jiàn)的靜置提取[4－5，7－8]、磁力攪拌提取[9－10]發(fā)展到超聲波輔助提取[11－13]、高壓[12]及高壓脈沖電場(chǎng)提取[13]，但大多仍采用較為簡(jiǎn)單的靜置和攪拌方式。Haines[9]和 Coates 等[10]雖采用了碳酸鹽緩沖溶液，但未與超聲波技術(shù)相結(jié)合;張大成[11]雖以堿性緩沖溶液輔助超聲波技術(shù)提取，但未探討各因素的影響顯著性;且他們均未具體研究提取物的免疫活性。故在此基礎(chǔ)上，本研究先將堿性碳酸鹽緩沖溶液與超聲波技術(shù)相結(jié)合提取凍干梅花鹿茸中可溶性蛋白，尋找出較優(yōu)提取工藝參數(shù)，再進(jìn)一步研究該蛋白提取物的非特異性免疫活性，為更加深入全面地開(kāi)發(fā)與利用鹿茸這一寶貴資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮梅花鹿鹿茸購(gòu)于雙陽(yáng)區(qū)鹿鄉(xiāng)鎮(zhèn)雙圣養(yǎng)殖場(chǎng)，碳酸鈉(AR)，碳酸氫鈉(AR)，牛血清白蛋白組份五(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，磷酸(AR)，考馬斯亮藍(lán)G－250(中國(guó)惠世生化試劑有限公司)，D25mm透析帶(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，注射用環(huán)磷酰胺(通化茂祥制藥有限公司)，印度墨水(上海Kayon生物科技有限公司)，溶菌酶(LZM)測(cè)試盒和酸性磷酸酶(ACP)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 儀器與設(shè)備

SP－722E型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司);SHIMADZU AUY220電子天平(島津國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司);大容量Xiang Yi H－2050R離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司);LGJ－12冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司);KQ－250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);JY92－Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司);FDV原泰奇氣引式粉碎機(jī)(佑奇有限公司);Delta 320酸度計(jì)(梅特勒－托利儀器上海有限公司);WP－UPS－20實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)(四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司);WD－2102型自動(dòng)酶標(biāo)儀(北京市六一儀器廠)。

1.3 研究方法

1.3.1 鹿茸粉的制備

將－80℃凍存鮮鹿茸于4℃下解凍，鋸成薄片，切成小塊，4℃預(yù)冷蒸餾水沖去血污后冷凍干燥，去毛，粉碎，采用索式提取法[14]脫去凍干鹿茸粉中脂肪，冷凍干燥，－80℃保存。

1.3.2 鹿茸可溶性蛋白的提取

稱取 0.5 g 鹿茸粉，精確至 0.0001 g，加入一定體積的4℃預(yù)冷浸提溶劑混合均勻，4℃條件下超聲波浸提一定時(shí)間，4000 r·min－1、4 ℃離心15 min，取上清液，超純水4℃透析48 h后冷凍干燥，超純水定容至50 mL，即為鹿茸蛋白提取液，4℃保存以備蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定。

1.3.3 鹿茸可溶性蛋白得率的測(cè)定

參考 Bradford 法[15]，分別移取 0.1 g·L－1標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，超純水補(bǔ)足至1.0 mL，加入 5.0 mL Bradford 工作液[16]，立即混勻，靜置5 min，在595 nm處測(cè)定吸光度(A)。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量為橫坐標(biāo)X，吸光度(A)值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程:Y=5.9429 X+0.0229，R2=0.9948。準(zhǔn)確移取0.2 mL鹿茸蛋白提取液，超純水補(bǔ)足至1.0 mL，按照上述操作測(cè)定595 nm處的吸光度值，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算鹿茸可溶性蛋白得率，公式如下:M=(x×V0)/(m×V)。式中:M為鹿茸可溶性蛋白得率;x為由線性回歸方程所求鹿茸蛋白提取液中蛋白質(zhì)量;V0為吸光度測(cè)定時(shí)取用鹿茸蛋白提取液體積;m為鹿茸粉質(zhì)量;V為鹿茸蛋白提取液總體積。

1.3.4 鹿茸可溶性蛋白提取單因素及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

提取時(shí)間的選擇:固定超聲溫度為4℃，提取溶劑為 0.05 mol·L－1、pH=10.0 的碳酸鹽緩沖溶液，液料比為20∶1，超聲功率為250 W，考察超聲提取時(shí)間為 5、10、15、20、25、30 min 時(shí)鹿茸可溶性蛋白得率的變化。

提取功率的選擇:固定超聲溫度為4℃，提取溶劑為 0.05 mol·L－1、pH=10.00 的碳酸鹽緩沖溶液，液料比為20∶1，超聲時(shí)間為5 min，考察超聲功率為 100、150、200、250、300 W 時(shí)鹿茸可溶性蛋白得率的變化。

液料比的選擇:固定超聲溫度為4℃，提取溶劑為 0.05 mol·L－1、pH=10.00 碳酸鹽緩沖溶液，超聲功率為250 W，超聲時(shí)間為5 min，考察液料比為5∶1、10∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1時(shí)鹿茸可溶性蛋白得率的變化。

提取溶劑濃度的選擇:固定超聲溫度為4℃，提取溶劑為pH=10.00碳酸鹽緩沖溶液，液料比為20∶1，超聲功率為250 W，超聲時(shí)間為5 min，考察緩沖溶液濃度為 0.01、0.02、0.05、0.10、0.20 mol·L－1時(shí)鹿茸可溶性蛋白得率的變化。

以鹿茸可溶性蛋白得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)(表1)，每個(gè)試驗(yàn)處理重復(fù)3次，優(yōu)化鹿茸可溶性蛋白提取工藝條件。

表1 梅花鹿茸可溶性蛋白提取工藝的正交試驗(yàn)因素與水平

1.3.5 鹿茸蛋白提取物的免疫活性試驗(yàn)

選取健康昆明小鼠40只，每組8只，雌雄各半，隨機(jī)分為鹿茸蛋白提取物低劑量組(低劑量組)、鹿茸蛋白提取物中劑量組(中劑量組)、鹿茸蛋白提取物高劑量組(高劑量組)、模型對(duì)照組和空白對(duì)照組。將鹿茸以1.3.4中所得最優(yōu)工藝連續(xù)提取3次后的提取液凍干，制得鹿茸蛋白提取物，溶于生理鹽水，分別以 200、400、800 mg·kg－1劑量對(duì)低、中、高劑量組小鼠進(jìn)行灌胃;模型對(duì)照組和空白對(duì)照組則給予10 mL·kg－1生理鹽水;每天1次，連續(xù)7 d。灌胃第2天和第3天時(shí)以100 mg·kg－1的劑量對(duì)除空白對(duì)照組之外的各組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺水溶液，致小鼠免疫功能低下。第8天摘眼球取血后，3500 r·min－1離心 10 min，取血清，頸椎脫臼法處死后取肝臟、脾臟。參照汪艷群[17]的方法進(jìn)行碳廓清試驗(yàn)，測(cè)定單核巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù);按照測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定血清溶菌酶含量、血清酸性磷酸酶和肝組織酸性磷酸酶活力。采用IBM SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

提取時(shí)間的選擇:超聲提取時(shí)間為 5、10、15、20、25、30 min時(shí)，鹿茸可溶性蛋白得率分別為29.891、30.451、31.051、31.672、31.471、31.227 mg·g－1?？梢?jiàn)，在5～20 min內(nèi)，隨著超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)，鹿茸可溶性蛋白得率逐漸增加，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，蛋白得率開(kāi)始緩慢下降。這是因?yàn)樵诙咳軇┲?，超聲破碎過(guò)程中蛋白的溶出[18]需要一定時(shí)間，當(dāng)?shù)鞍兹艹鲒呌诜€(wěn)定后，即使再超聲處理其質(zhì)量分?jǐn)?shù)也不再增加，相反由于長(zhǎng)時(shí)間的超聲波剪切作用可能導(dǎo)致部分蛋白變性，溶解性變差[19]因而得率下降。

提取功率的選擇:超聲提取功率分別為100、150、200、250、300 W 時(shí)，鹿茸可溶性蛋白得率分別為 34.282、36.505、36.786、35.271、34.984 mg·g－1。可知，鹿茸可溶性蛋白得率隨著超聲功率的增大而增加，當(dāng)超聲功率增大至200 W時(shí)蛋白得率達(dá)到最高，繼續(xù)增大超聲功率，蛋白得率反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)橐婚_(kāi)始超聲功率較小，逐漸增大超聲功率會(huì)增強(qiáng)對(duì)物料的破碎程度，使蛋白更容易溶出，但當(dāng)超聲功率增大到一定程度時(shí)，過(guò)大的破碎力度使已經(jīng)浸出的部分蛋白結(jié)構(gòu)破壞以至變性[18，20]，從而導(dǎo)致蛋白得率下降。

液料比的選擇:液料比分別為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25 ∶1時(shí)，鹿茸可溶性蛋白得率分別為 22.398、33.640、33.276、34.603、35.649 mg·g－1。可見(jiàn)，鹿茸可溶性蛋白得率隨溶劑用量增加而顯著升高，液料比達(dá)到10∶1后蛋白得率趨于平穩(wěn)。因?yàn)槿軇┯昧枯^少時(shí)，整個(gè)溶液體系的濃度較高，黏度較大[20]，對(duì)蛋白的傳質(zhì)過(guò)程起到一定阻礙作用;適當(dāng)增加溶劑用量后，減小了溶液的濃度和黏度，有利于蛋白的溶出;繼續(xù)加大液料比，蛋白得率增加趨于平緩，說(shuō)明此時(shí)蛋白溶出趨于穩(wěn)定，在溶劑中的擴(kuò)散達(dá)到平衡狀態(tài)。

提取溶劑濃度的選擇:提取溶劑濃度分別為0.01、0.02、0.05、0.10、0.20 mol·L－1時(shí)，鹿茸可溶性蛋白得率分別為 21.006、22.500、23.807、23.548、24.151 mg·g－1?？芍?，鹿茸可溶性蛋白得率隨著提取溶劑濃度的增大呈逐漸增加趨勢(shì)，當(dāng)提取溶劑濃度為0.05 mol·L－1時(shí)達(dá)到一個(gè)峰值，繼續(xù)提高濃度，蛋白得率逐漸趨于平穩(wěn)。大部分蛋白質(zhì)均溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中，緩沖溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶度大，是提取蛋白質(zhì)的常用溶劑。不同濃度的緩沖溶液離子強(qiáng)度不同，對(duì)蛋白質(zhì)的溶解和吸附能力不同。

2.2 正交試驗(yàn)

按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，不同組合條件下鹿茸可溶性蛋白得率依次為 33.609、35.169、34.142、35.918、35.441、36.807、35.450、34.587、34.226 mg·g－1。由表2和表3可知，各因素對(duì)鹿茸可溶性蛋白得率的影響主次順序依次為A、D、C、B，其中A和D影響極顯著，C和B影響不顯著。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得到超聲法提取鹿茸可溶性蛋白的最優(yōu)水平組合為A2B2C2D2。由于這一水平組合未在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，故對(duì)其進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得鹿茸可溶性蛋白得率為36.849 mg·g－1，高于正交試驗(yàn)中第6號(hào)處理的結(jié)果，故最終確定提取溶劑濃度0.05 mol·L－1，液料比10 ∶1，超聲提取功率 200 W，超聲提取時(shí)間20 min為最優(yōu)工藝條件。

表2 梅花鹿茸可溶性蛋白提取工藝正交試驗(yàn)的直觀分析結(jié)果 mg·g－1

表3 梅花鹿茸可溶性蛋白提取工藝正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

2.3 鹿茸蛋白提取物的免疫活性

由表4可知，與模型對(duì)照組比較，鹿茸蛋白提取物中、高劑量組的單核巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)顯著增加，低劑量組雖也增加但差異不顯著;各劑量組均高于空白對(duì)照組，但差異不顯著。各劑量組的血清溶菌酶質(zhì)量濃度均高于模型對(duì)照組和空白對(duì)照組，除低劑量組與空白對(duì)照組差異不顯著外，其余均有顯著差異。各劑量組的血清酸性磷酸酶和肝組織酸性磷酸酶活力均顯著高于模型對(duì)照組和空白對(duì)照組。據(jù)此可知，鹿茸蛋白提取物能夠增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞活性，對(duì)其非特異性免疫功能具有積極調(diào)節(jié)作用，表現(xiàn)出良好的免疫活性。

表4 鹿茸蛋白提取物對(duì)小鼠非特異性免疫功能的影響

3 結(jié)論

采用超聲波輔助法提取梅花鹿茸可溶性蛋白，以鹿茸可溶性蛋白得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)結(jié)果得知，提取溶劑pH=10.00的碳酸鹽緩沖溶液濃度和液料比對(duì)鹿茸可溶性蛋白的提取影響極顯著，超聲提取功率和超聲提取時(shí)間影響不顯著。在pH=10.00的碳酸鹽緩沖溶液濃度為0.05 mol·L－1，液料比 10 ∶1，超聲提取功率 200 W，超聲提取時(shí)間20 min的條件下，鹿茸可溶性蛋白得率最高，為 36.849 mg·g－1。通過(guò)免疫活性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鹿茸蛋白提取物能夠提高免疫功能低下小鼠的單核巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)、血清溶菌酶質(zhì)量濃度、血清及肝組織中酸性磷酸酶活力，積極調(diào)節(jié)小鼠非特異性免疫功能，具有良好的免疫活性。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版:1部[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:303.

[2]Kawtikwar P S，Bhagwat D A，Sakarkar D M.Deer antlers-traditional use and future perspectives[J].Indian Journal of Traditonal Knowledge，2010，9(2):245－251.

[3]謝云.鹿茸中活性組分的分離純化與表征[D].福州:福州大學(xué)，2006.

[4]岳喜慶，徐明，王瀾儒.響應(yīng)曲面法優(yōu)化鹿茸蛋白提取條件[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2011，32(9):59－62.

[5]李繼海.梅花鹿茸活性成分提取分離、功能評(píng)價(jià)及功能食品研究[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[6]吳荻，魏征人，陳智嘉，等.吉林省雙陽(yáng)梅花鹿鹿茸蛋白組分的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2012，16(5):795－798.

[7]潘思羽.凍鮮馬鹿茸蛋白成分的分離與活性初探[D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué)，2010.

[8]趙大瑋，李丹，陳智嘉，等.吉林省雙陽(yáng)梅花鹿鹿茸水溶性蛋白組分的提取及對(duì)小鼠主要臟器病理形態(tài)學(xué)的影響[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2011，37(3):448－451.

[9]Haines S R.Low molecular weight extraction process:US，7547761B2[P].2009－06－16.

[10]Coates D E，Haines S R，Suttie J M.Deer antler extract for promoting angiogenesis:US，2007/0026084A1[P].2007－01－01.

[11]張大成.鹿茸中胰島素樣生長(zhǎng)因子－1的提取及純化研究[D].天津:天津大學(xué)，2008.

[12]郭文晶，從福仲，張守勤.鹿茸蛋白的高壓提取及生物活性測(cè)試[C].武漢:智能信息技術(shù)應(yīng)用學(xué)會(huì)，2010:459－463.

[13]劉唯佳.鹿茸中水溶性蛋白質(zhì)的提取及鹿茸綜合利用的研究[D].長(zhǎng)春:吉林大學(xué)，2013.

[14]張水華.食品分析[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2009:97.

[15]Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of proteins utilizing the principle of protein binding[J].Analytical Biochemistry，1976，72:248－254.

[16]汪家政，范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社，2000:43.

[17]汪艷群.五味子多糖的分離、結(jié)構(gòu)鑒定及免疫活性研究[D].沈陽(yáng):沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[18]王艷萍，李雙喜，程巧玲.超聲提取蠶豆蛋白的研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2008，29(5):70－72.

[19]袁道強(qiáng)，王丹丹.超聲波法提取小麥胚芽蛋白的研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2007，28(3):1－4.

[20]胡愛(ài)軍，田方園，盧秀麗，等.亞麻餅粕蛋白的超聲輔助提取工藝研究[J].食品與發(fā)酵科技，2013，49(3):30－32，100.