劉玉潔 劉軍花 許婷婷 毛勝勇

(南京農業(yè)大學動物科技學院，南京 210095)

在現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖中，為追求最大經濟效益，生產者常給牛羊飼喂高精料。由于過多精料不能在瘤胃及小腸內完全消化，部分精料進入后腸，在后腸大量發(fā)酵，結果導致后腸內pH大幅下降，同時產生大量內毒素等異常代謝產物［1］。后腸中過量的內毒素及低pH可引發(fā)腸炎，使腸黏膜結構受損。腸炎可導致動物采食量下降，引發(fā)腹瀉等腸道疾病，最終給畜牧生產帶來較大的經濟損失。因此，探索有助于在高精料條件下維持動物腸黏膜正常結構和緩解腸炎的措施，對于保障動物腸道健康及生產性能的發(fā)揮具有重要理論價值與研究意義。

谷氨酰胺(glutamine，Gln)是血液循環(huán)和組織內游離氨基酸池中含量最豐富的一種氨基酸，是腸黏膜主要的能量來源。研究顯示，谷氨酰胺可改善腸炎患者全身免疫功能和營養(yǎng)代謝狀態(tài)［2］;可減少三硝基苯磺酸誘導結腸炎的小鼠腸黏膜腫瘤壞死因子α(TNF-α)的產生和釋放［3］。在泌乳奶牛上的應用效果表明，添加谷氨酰胺可增強宿主的免疫應答［4-5］，顯示谷氨酰胺在奶牛生產中具有應用前景，但其是否具有保護反芻動物腸道健康的作用，目前尚不清楚。本試驗擬利用飼喂高精料的奶山羊為模型動物，研究添加谷氨酰胺對其盲腸黏膜形態(tài)和炎癥因子mRNA表達的影響，以期闡明谷氨酰胺在保護后腸健康上的效果，為實際生產提供新策略。

1 材料與方法

試驗于2012年1月至2012年4月在南京農業(yè)大學動物房進行。

1.1 試驗設計

選用12頭健康、體重［(41.5±0.8)kg］相近的2.5歲的經產薩能奶山羊母羊，按常規(guī)手術方法安裝永久性瘤胃瘺管，統(tǒng)一驅蟲、單欄飼養(yǎng)。高精料基礎飼糧參考NRC(2004)標準配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1，精粗比為7∶3。飼喂量(干物質基礎)為1.3 kg/d。每日分2次(08:00和17:30)等量飼喂，自由飲水。

采用隨機區(qū)組設計將12頭健康奶山羊隨機分為對照組(n=6，飼喂高精料)和谷氨酰胺組(n=6，谷氨酰胺添加量為50 g/d)。試驗期28 d。

表1 高精料基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the high concentrate basal diet(air-dry basis) %

1.2 試驗材料

谷氨酰胺以過瘤胃谷氨酰胺形式添加，由浙江康德權科技有限公司生產。

主要儀器:pH計(HI 9125，意大利HANNA Instruments)、GC-14B氣相色譜儀(日本島津)、掃描電子顯微鏡(S-3000N，日本HITACHI)、透射電子顯微鏡(H-7650，日本日立)、微量分光光度計(NanoDrop 1000，美國 Thermo)、實時定量PCR儀(StepOnePlusTMReal-Time PCR System，美國Applied Biosystems)。

1.3 盲腸內容物和黏膜采集

在試驗期結束后屠宰山羊，迅速采集盲腸內容物和黏膜樣，內容物pH用pH計迅速測定。內容物與雙蒸水1:1稀釋后3 600 r/min下離心10 min，取離心后的上清液，經常規(guī)處理后，-20℃凍存，備測揮發(fā)性脂肪酸、乳酸和內毒素濃度。盲腸黏膜樣用冰磷酸緩沖液清洗干凈后，分成2等份。第1份用4%多聚甲醛固定，用于石蠟切片;第2份用2.5%戊二醛固定，用于掃描和透射電鏡觀察。盲腸粘膜樣于液氮保存，用于總RNA抽提。

1.4 測定指標

1.4.1 盲腸發(fā)酵參數(shù)

盲腸內容物內毒素和乳酸濃度的測定分別參照張瑞陽等［6］和龍黎明等［7］的試驗方法。盲腸內容物揮發(fā)性脂肪酸濃度采用氣相色譜法測定，溫度條件為:柱溫110℃，氣化室溫度180℃，檢測室溫度180 ℃［8］。

1.4.2 盲腸黏膜形態(tài)

用4%多聚甲醛固定，洗滌、酒精梯度脫水、浸蠟、包埋、切片、貼片、脫蠟復水、蘇木精-伊紅染色、封固，在光鏡下觀察盲腸黏膜形態(tài)。

用冰磷酸緩沖液反復清洗樣品，2.5%的戊二醛固定后，磷酸鹽緩沖液清洗，采用乙醇脫水后，冷凍干燥儀干燥樣品，用離子濺射儀鍍膜，掃描電子顯微鏡進行觀察。透射電鏡試驗中的樣品前處理與掃描電鏡預處理一致，綴以1%的鋨酸固定，乙醇梯度脫水，用丙酮置換后，浸漬、包埋、聚合、后修塊使樣品表面積小于0.2 mm×0.2 mm，超薄切片，經鈾染色與鉛染色清洗后，透射電子顯微鏡觀察盲腸黏膜形態(tài)。

1.4.3 炎癥因子mRNA表達量

盲腸黏膜的總RNA的提取參照Chomczynski等［9］的方法，采用微量分光光度計測定總RNA濃度和純度。反轉錄條件與引物參照文獻［10-11］，反轉錄產物于-20℃儲存?zhèn)溆谩２捎脤崟r定量PCR儀評估盲腸黏膜中TNF-α、干擾素γ(IFN-γ)、白細胞介素 1β(IL-1β)、白細胞介素 6(IL-6)和白細胞介素10(IL-10)mRNA的表達量，相對定量采用 2-△△Ct法。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0中獨立性t檢驗進行統(tǒng)計分析。顯著性水平置于P＜0.05。

2 結果

2.1 盲腸發(fā)酵參數(shù)及內毒素濃度

由表2可見，高精料條件下，盲腸內容物pH約為7.00，總揮發(fā)性脂肪酸濃度達101.70 mmol/L，內毒素濃度達5.14 lg(EU/g)，添加谷氨酰胺對盲腸內容物pH以及揮發(fā)性脂肪酸、乳酸及內毒素濃度皆無顯著影響(P＞0.05)。

表2 谷氨酰胺對飼喂高精料奶山羊盲腸發(fā)酵參數(shù)及內毒素濃度的影響Table 2 Effects of glutamine on cecal fermentation parameters and endotoxin concentration of dairy goats fed a high concentrate diet

2.2 盲腸黏膜形態(tài)

光學顯微鏡觀察可見，對照組的盲腸黏膜發(fā)生脫落(圖1-A)，而谷氨酰胺組的盲腸黏膜表面完整(圖1-B);掃描電鏡觀察可見，對照組盲腸黏膜出現(xiàn)大面積的損傷(圖1-C)，谷氨酰胺組盲腸黏膜無病理性的變化(圖1-D);透射電鏡觀察可見，對照組的橋粒清晰可見，但緊密連接密度降低(圖1-E)，谷氨酰胺組的橋粒和緊密連接結構均完整，連接結構致密(圖1-F)。

2.3 盲腸黏膜炎癥因子mRNA表達量

由表3可見，添加谷氨酰胺顯著降低了奶山羊盲腸黏膜中 TNF-α mRNA的表達量(P＜0.05)，但對盲腸黏膜 IFN-γ、IL-1β、IL-6 和 IL-10的mRNA表達量無顯著影響(P＞0.05)。

3 討論

盲腸是反芻動物除瘤胃外的另一主要發(fā)酵器官，除具有消化、吸收及分泌的功能外，作為消化道黏膜屏障的重要組成部分，盲腸黏膜結構對維持機體正常生理功能起著重要作用。研究表明，后腸黏膜屏障可阻止腸腔內的毒素和微生物等穿透黏膜進入循環(huán)系統(tǒng)［12］。在腸黏膜屏障中，腸黏膜上皮細胞及其細胞間的各種連接結構是腸道抵御外環(huán)境中有害物質或病原體入侵腸黏膜的關鍵，是維持腸黏膜屏障功能的結構基礎［13］，因此，維持腸黏膜結構的完整對于維護腸屏障功能至關重要。相關報道顯示，當動物采食高精料時，后腸內環(huán)境紊亂，腸黏膜損傷，其原因可能涉及后腸低pH及高濃度內毒素等毒物因子［1］。本試驗中，對照組盲腸內容物中內毒素的濃度高達1×105EU/g，同時盲腸黏膜表面受損，緊密連接超微結構受到破壞，結果說明，飼喂高精料可導致盲腸黏膜結構受損，提示該條件下腸黏膜屏障可能受損。但由于本試驗未能采用尤斯室(Ussing Chamber)等儀器研究后腸黏膜的通透性的具體變化情況，因而黏膜屏障到底受到多大程度的損傷，尚不清楚。但本試驗結果顯示，高精料可導致奶山羊后腸發(fā)酵異常，后腸黏膜結構受到破壞，該結果也與 Gressley等［1］的報道一致。

圖1 谷氨酰胺對飼喂高精料奶山羊盲腸黏膜形態(tài)的影響Fig.1 Effects of glutamine on cecal mucosal morphology of dairy goats fed a high concentrate diet

表3 谷氨酰胺對飼喂高精料奶山羊盲腸黏膜炎癥因子mRNA表達量的影響Table 3 Effects of glutamine on the mRNA expression levels of inflammatory cytokines of cecal mucosal of dairy goats fed a high concentrate diet

在人和單胃動物腸道營養(yǎng)上的研究表明，谷氨酰胺是腸黏膜細胞的重要能源物質，可促進黏膜的生長、修復及完整性的維持［14］。本試驗結果表明，較對照組而言，添加外源性谷氨酰胺使緊密連接超微結構受到保護，有助于維持腸表面正常的形態(tài)，結果表明，谷氨酰胺對盲腸黏膜結構的完整性具有保護作用，該結果也與谷氨酰胺在人和單胃動物腸道營養(yǎng)中的研究報道基本一致，其具體機制可能涉及谷氨酰胺可維持腸黏膜緊密連接結構和促進腸細胞的生長，從而保障了后腸黏膜的完整性的機制。

本試驗中，后腸黏膜表面發(fā)生脫落，緊密連接超微結構受損，提示后腸黏膜可能局部受損，引發(fā)局部炎癥。同時，Emmanuel等［15］報道，低 pH 與高濃度內毒素可導致結腸黏膜通透性增加，使內毒素移位。移位的內毒素可進一步刺激機體產生大量TNF-α和IL-1β等細胞因子，加劇黏膜炎癥。本試驗中，較對照組而言，盡管谷氨酰胺組與對照組盲腸內容物pH與內毒素濃度大致相當，但TNF-α mRNA表達量顯著降低，該結果說明，谷氨酰胺組中的較完整腸黏膜結構可能部分阻止了腸腔內毒素等毒物因子的移位，從而削弱了這些毒物引發(fā)的腸炎反應。但本試驗發(fā)現(xiàn)，作者所檢測的5個炎癥因子中，添加谷氨酰胺僅降低了盲腸內 TNF-α 的 mRNA表達量，對盲腸內 IFN-γ、IL-1β、IL-6和IL-10的mRNA表達量無顯著影響。該結果說明，在飼喂高精料飼糧時，添加谷氨酰胺僅能在一定程度上保護腸黏膜結構的完整，部分降低高精料引發(fā)的后腸炎癥。

4 結論

高精料條件下，添加谷氨酰胺可加強盲腸黏膜緊密連接，一定程度上緩解盲腸黏膜的炎癥反應，有助于維持后腸黏膜屏障的正常功能。

［1］GRESSLEY T F，HALL M B，ARMENTANO L E.Ruminant nutrition symposium:productivity，digestion，and health responses to hindgut acidosis in ruminants［J］.Journal of Animal Science，2011，89(4):1120-1130.

［2］馬曉菁，馬兵，謝東珊，等.谷氨酰胺對嚴重燒傷后腸黏膜和機體免疫功能保護作用的臨床觀察［J］.西安交通大學學報，2009，30(3):359-362.

［3］AMEHO C K，ADJEI A A，HARRISON E K，et al.Prophylactic effect of dietary glutamine supplementation on interleukin 8 and tumour necrosis factor á production in trinitrobenzene sulphonic acid induced colitis［J］.Gut，1997，41(4):487-493.

［4］CAROPRESE M，ALBENZIO M，MARINO R，et al.Dietary glutamine enhances immune responses of dairy cows under high ambient temperature［J］.Journal of Dairy Science，2013，96(5):3002-3011.

［5］CAROPRESE M，ALBENZIO M，MARINO R，et al.Immune response and milk production of dairy cows fed graded levels of rumen-protected glutamine［J］.Research in Veterinary Science，2012，93(1):202-209.

［6］張瑞陽，王東升，朱偉云，等.奶牛靜脈血內毒素濃度及其與產奶量的相關性［J］.動物營養(yǎng)學報，2012，24(5):822-827.

［7］龍黎明，毛勝勇，蘇勇，等.一株瘤胃源乳酸利用菌的分離鑒定及其體外代謝特性［J］.微生物學報，2008，48(12):1571-1577.

［8］秦為琳.應用氣相色譜測定瘤胃揮發(fā)性脂肪酸方法的研究改進［J］.南京農業(yè)大學學報1982，5(4):110-116.

［9］CHOMCZYNSKI P，SACCHI N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanatephenol-chloroform extraction［J］.Analytical Biochemistry，1987，162(1):156-159.

［10］LIU J H，XU T T，LIU Y J，et al.A high-grain diet causes massive disruption of ruminal epithelial tight junctions in goats［J］.American Journal of Physiology:Regulatory，Integrative and Comparative Physiology，2013，305(3):232-241.

［11］DERVISHIA E，SERRANOB C，JOYA M，et al.The effect of feeding system in the expression of genes related with fat metabolism in semitendinous muscle in sheep［J］.Meat Science，2011，89(1):91-97.

［12］李曉芳.嚴重燒傷后胃腸道功能障礙的機制和防治［J］.世界華人消化雜志，2006，14(9):888-893.

［13］蔡文娟，章明放.上皮緊密連接與炎性腸病的研究進展［J］.醫(yī)學綜述，2011，17(15):2274-2276.

［14］RAO R K，SAMAK G.Role of glutamine in protection of intestinal epithelial tight junctions［J］.Journal of Epithelial Biology and Pharmacology，2012，5(1):47-54.

［15］EMMANUEL D G，MADSEN K L，CHURCHILL T A，et al.Acidosis and lipopolysaccharide from Escherichia coli B∶055 cause hyperpermeability of rumen and colon tissues［J］.Journal of Dairy Science，2007，90(12):5552-5557.