王明科, 陳雙紅, 潘滬湘, 巴劍波, 陶永華,*

1. 海軍醫(yī)學(xué)研究所，上海 200433 2. 解放軍441醫(yī)院，福鼎 355200

甲醛對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞的毒性及N-乙酰半胱氨酸的保護(hù)作用

王明科1,2, 陳雙紅1, 潘滬湘1, 巴劍波1, 陶永華1,*

1. 海軍醫(yī)學(xué)研究所，上海 200433 2. 解放軍441醫(yī)院，福鼎 355200

為研究甲醛對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞存活率的影響及N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)的保護(hù)效應(yīng)，以0、50、100、150、200、300和400 μmol·L-1甲醛處理人支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞24 h，200 μmol·L-1甲醛處理BEAS-2B細(xì)胞0、6、24和48 h。以不同濃度(0、0.1、1和10 mmol·L-1)NAC預(yù)處理1 h或不同時(shí)間(預(yù)先3、1 h加入NAC、同時(shí)加入甲醛和NAC及加入200 μmol·L-1甲醛1、3 h后)加入1 mmol·L-1NAC，再以200 μmol·L-1甲醛處理BEAS-2B細(xì)胞(甲醛處理時(shí)間均為24 h)，CCK-8(cell counting kit-8)實(shí)驗(yàn)和倒置相差顯微鏡觀(guān)察甲醛對(duì)BEAS-2B細(xì)胞存活率的影響及NAC的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，甲醛以劑量依賴(lài)性方式引起B(yǎng)EAS-2B細(xì)胞死亡。200 μmol·L-1甲醛處理BEAS-2B細(xì)胞6 h，細(xì)胞存活率下降，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p <0.05)。隨甲醛處理時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞存活率明顯下降，存在時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。不同濃度和不同時(shí)間NAC處理可拮抗甲醛引起的細(xì)胞存活率下降，存在劑量效應(yīng)關(guān)系，NAC不同時(shí)間處理組間細(xì)胞存活率未見(jiàn)明顯差異。研究表明，甲醛以劑量和時(shí)間依賴(lài)性方式引起支氣管上皮細(xì)胞存活率下降，NAC以劑量依賴(lài)性方式對(duì)甲醛引起的損傷具有保護(hù)作用。

甲醛；人支氣管上皮細(xì)胞；N-乙酰半胱氨酸；保護(hù)作用

甲醛是艦船艙室和現(xiàn)代建筑常見(jiàn)的高毒類(lèi)化學(xué)污染物，廣泛地存在于塑料制品、樹(shù)脂和建筑材料，也是家庭常用品如食品防腐劑、化妝品、消毒劑和殺菌劑的組分。此外，甲醛也是某些自然活動(dòng)(如火災(zāi))和人類(lèi)活動(dòng)(如吸煙和汽車(chē)燃料燃燒)的副產(chǎn)物[1-2]。甲醛作為人類(lèi)致癌物，已被確定可引起鼻咽癌并可能引起白血病，甲醛暴露還可引起其他多種健康問(wèn)題如急慢性毒性、免疫毒性、造血毒性、生殖毒性、遺傳毒性等，與苯系物還可能存在聯(lián)合毒性作用[3-6]。呼吸道吸入是甲醛進(jìn)入人體的主要方式，呼吸系統(tǒng)也是甲醛侵害人體的首要靶器官。研究發(fā)現(xiàn)，甲醛可引起肺組織病理?yè)p傷, 炎細(xì)胞浸潤(rùn)，炎性細(xì)胞因子表達(dá)增強(qiáng)[7-9]，吸入甲醛可加重哮喘大鼠氣道阻力和氣道炎癥反應(yīng)[10]，也被用來(lái)制作急性肺水腫模型[11]，利用流行病學(xué)調(diào)查方法發(fā)現(xiàn)甲醛作業(yè)工人阻塞性肺功能通氣功能障礙異常率增高[12]，室內(nèi)甲醛濃度過(guò)高引起居民產(chǎn)生呼吸系統(tǒng)癥狀的危險(xiǎn)性增大[13]，但職業(yè)性甲醛暴露與肺癌的關(guān)系目前尚有爭(zhēng)論[14]。神經(jīng)源性炎癥、遺傳毒性和致突變性、氧化損傷、表觀(guān)遺傳學(xué)改變等機(jī)制可能與甲醛對(duì)呼吸系統(tǒng)的毒性作用有關(guān)[15-18]。

N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是天然存在的氨基酸L-半胱氨酸乙酰化的衍生物，分子內(nèi)含有-SH基團(tuán)，具有抗氧化、抗誘變、抗癌等多種藥理特性，作為經(jīng)典的化痰藥物最早應(yīng)用于上世紀(jì)60年代，現(xiàn)已被用于慢性阻塞性肺病、流行性感冒、急性肺損傷、特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化等多種呼吸系統(tǒng)疾病的治療，對(duì)癌癥、藥物及重金屬中毒、心臟病、帕金森氏病、吸煙損害、消化系疾病如肝炎、胰腺炎及其他以自由基氧化損傷為特征的疾病均有潛在的治療作用[19-20]。NAC可通過(guò)直接抗氧化及提高細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量間接抗氧化、抑制炎癥、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和防止核酸分子損傷等多種機(jī)制發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[21-22〗。研究報(bào)道，NAC能夠減輕尼古丁、內(nèi)毒素及順鉑等物質(zhì)誘導(dǎo)的I型肺泡上皮細(xì)胞的凋亡[23-25]，也能抑制香煙提取物誘導(dǎo)的II型肺泡上皮細(xì)胞凋亡[26]，對(duì)甲醛誘導(dǎo)的NIH3T3細(xì)胞[27]、成骨細(xì)胞[28〗損傷也具有保護(hù)作用。此外，NAC還能抑制甲醛誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞酪氨酸磷酸化[29]，對(duì)甲醛引起的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降也有保護(hù)作用[30-31]。但NAC對(duì)甲醛誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞損傷是否具有保護(hù)作用，目前未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬以人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B)為研究對(duì)象，探討甲醛對(duì)支氣管上皮細(xì)胞存活率的影響及NAC的保護(hù)效應(yīng)。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

1.1.1 試劑

胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購(gòu)自Gibcol，PBS、RMPI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone，青霉素、鏈霉素購(gòu)自上海博光。37%甲醛溶液為上海市國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司分析純?cè)噭?6孔、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自Corning。CCK-8(cell counting kit-8)試劑盒、NAC均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 細(xì)胞

人支氣管上皮細(xì)胞株BEAS-2B 購(gòu)自ATCC(American type culture collection)。

1.3 儀器

Model 3110 CO2恒溫培養(yǎng)箱為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品。SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。μQuant MQX200 酶標(biāo)儀為美國(guó)Bio-Tek公司產(chǎn)品。CKX31倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本Olympus，MD50數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)購(gòu)自廣州明美。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 BEAS-2B細(xì)胞的培養(yǎng)

參考ATCC提供的方法，常規(guī)復(fù)蘇BEAS-2B細(xì)胞，采用含100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1鏈霉素、10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，每2～3天換一次液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)

根據(jù)CCK-8試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)操作，步驟簡(jiǎn)要介紹如下：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BEAS-2B細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后按1×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后將BEAS-2B細(xì)胞分成：(1) 空白組：加入細(xì)胞培養(yǎng)液但不種植細(xì)胞。(2)對(duì)照組：細(xì)胞正常培養(yǎng)。(3)實(shí)驗(yàn)組：不同實(shí)驗(yàn)處理。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組處理后取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各5或6孔，空白組1孔，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，37℃孵育1～3 h。選擇450 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光度(D)值。按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=(D實(shí)驗(yàn)組-D空白組)/(D對(duì)照組-D空白組)×100%。

1.4.3 甲醛對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的毒性

不同濃度甲醛對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的損傷：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BEAS-2B細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化后按5×104/孔接種于24孔培養(yǎng)板，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后在100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1鏈霉素、10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基中加入終濃度0、50、100、200和400 μmol·L-1甲醛處理24 h，倒置顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，照相保存結(jié)果。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BEAS-2B細(xì)胞，按1×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后加入終濃度0、50、100、150、200、300和400 μmol·L-1甲醛處理24 h，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)計(jì)算細(xì)胞存活率，利用SPSS18.0軟件以細(xì)胞存活率對(duì)劑量作圖，計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50。

甲醛處理不同時(shí)間對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的損傷：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BEAS-2B細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化后按1×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后加入終濃度200 μmol·L-1甲醛處理0、6、24和48 h，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4.4 NAC對(duì)甲醛致BEAS-2B細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BEAS-2B細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化后按5×104/孔接種于24孔培養(yǎng)板，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后將BEAS-2B細(xì)胞分成：(1) 對(duì)照組：細(xì)胞正常培養(yǎng)。(2)甲醛組：在100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1鏈霉素、10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基加入終濃度為200 μmol·L-1甲醛。(3)NAC+甲醛組：加入1 mmol·L-1NAC預(yù)處理BEAS-2B細(xì)胞1 h，再加入終濃度為200 μmol·L-1甲醛。37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，照相保存結(jié)果。

不同濃度NAC對(duì)甲醛致BEAS-2B細(xì)胞損傷的保護(hù)作用：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BEAS-2B細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化后按1×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后加入不同濃度(0、0.1、1和10 mmol·L-1)NAC預(yù)處理1 h，再以200 μmol·L-1甲醛處理BEAS-2B細(xì)胞24 h，同時(shí)以BEAS-2B細(xì)胞正常培養(yǎng)為對(duì)照組，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)計(jì)算細(xì)胞存活率。

NAC不同時(shí)間對(duì)甲醛致BEAS-2B細(xì)胞損傷的保護(hù)作用：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BEAS-2B細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化后按1×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后在不同時(shí)間(預(yù)先3、1 h、同時(shí)加入及加入200 μmol·L-1甲醛1、3 h后)加入1 mmol·L-1NAC，再以200 μmol·L-1甲醛處理(NAC不同時(shí)間組甲醛處理時(shí)間均為24 h)，同時(shí)設(shè)立BEAS-2B細(xì)胞正常培養(yǎng)組及200 μmol·L-1甲醛處理24 h組，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果(Results)

2.1 不同濃度甲醛對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的損傷

正常培養(yǎng)條件下人支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞呈貼壁單層生長(zhǎng)，梭形或多角形，相鄰細(xì)胞間連接較為緊密(圖1A)。50、100 μmol·L-1甲醛處理24 h倒置顯微鏡觀(guān)察可見(jiàn)少量BEAS-2B細(xì)胞死亡(圖1B和C)，200 μmol·L-1甲醛處理24 h后倒置顯微鏡觀(guān)察可見(jiàn)BEAS-2B細(xì)胞大量細(xì)胞變圓，培養(yǎng)液中有碎片漂浮(圖1D)。400 μmol·L-1甲醛處理24 h后BEAS-2B細(xì)胞死亡進(jìn)一步加重(圖1E)。圖2是CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)計(jì)算后的細(xì)胞存活曲線(xiàn)，50 μmol·L-1甲醛處理24 h后與正常對(duì)照組比較BEAS-2B細(xì)胞存活率即下降(圖2)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p <0.05)。100 μmol·L-1與50 μmol·L-1甲醛組細(xì)胞存活率無(wú)明顯差異(p >0.05)，隨甲醛劑量增加BEAS-2B細(xì)胞存活率下降，存在劑量效應(yīng)關(guān)系，利用SPSS18.0軟件以細(xì)胞存活率對(duì)劑量作圖，可得甲醛的半數(shù)抑制濃度IC50為146.15 μmol·L-1。

圖1 不同濃度甲醛對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的損傷，A、B、C、D、E中甲醛濃度分別為0、50、100、200和400 μmol·L-1Fig. 1 BEAS-2B cells damage after exposure to different concentrations of formaldehyde at 0(A), 50(B), 100(C), 200(D) and 400 μmol·L-1(E)

圖2 甲醛處理后BEAS-2B細(xì)胞存活曲線(xiàn)注：*: p<0.05，與對(duì)照組比較，a、b、c和d: p<0.05，分別與50、100、150和200 μmol·L-1甲醛組比較。Fig. 2 The survival curve of BEAS-2B cells induced by formaldehydeNote： *: p<0.05, compared with the control group，a, b, c and d: p<0.05，compared with the formaldehyde group at 50, 100, 150 and 200 μmol·L-1 respectively.

2.2 甲醛處理不同時(shí)間對(duì)BEAS-2B細(xì)胞存活率的影響

通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，200 μmol·L-1甲醛處理BEAS-2B細(xì)胞6 h與對(duì)照組比較細(xì)胞存活率下降，為58.02%±8.36%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p <0.05)。200 μmol·L-1甲醛處理24、48 h BEAS-2B細(xì)胞存活率繼續(xù)下降，分別為28.27%±7.94%、16.65%±1.63%，48 h內(nèi)隨甲醛處理時(shí)間延長(zhǎng)BEAS-2B細(xì)胞存活率明顯下降(p <0.05)，存在時(shí)間效應(yīng)關(guān)系(圖3)。2. 3 NAC對(duì)甲醛致BEAS-2B細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

由圖4可見(jiàn)，倒置顯微鏡觀(guān)察BEAS-2B細(xì)胞正常培養(yǎng)條件下呈現(xiàn)支氣管上皮貼壁單層生長(zhǎng)、梭形或多角形、相鄰細(xì)胞間連接較為緊密的細(xì)胞學(xué)形態(tài)學(xué)特點(diǎn)(圖4A)。200 μmol·L-1甲醛處理24 h后可見(jiàn)大量細(xì)胞死亡 (圖4B)。加入1 mmol·L-1NAC預(yù)處理1 h可使死亡細(xì)胞減少，相鄰細(xì)胞間恢復(fù)緊密連接狀態(tài)，說(shuō)明NAC可減少甲醛誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞死亡，NAC對(duì)甲醛誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞損傷具有保護(hù)效應(yīng)(圖4C)。

圖3 200 μmol·L-1甲醛處理不同時(shí)間對(duì)BEAS-2B細(xì)胞存活率的影響注：*: p< 0.05，與對(duì)照組比較，a: p<0.05，與甲醛組處理6 h比較，b: p< 0.05，與甲醛組處理24 h比較Fig. 3 Time-effect of 200 μmol·L-1 formaldehyde on the viability of BEAS-2B cellsNote: *: p< 0.05, compared with the control group，a: p< 0.05, compared with the formaldehyde group treated for 6 h，b: p< 0.05, compared with the formaldehyde group treated for 24 h

圖4 NAC對(duì)甲醛致BEAS-2B細(xì)胞損傷的保護(hù)作用A：對(duì)照組，B：甲醛組，C：NAC+甲醛組Fig. 4 The protective effect of NAC on formaldehyde-induced BEAS-2B cells damageA: control group, B: formaldehyde group, C: NAC+formaldehyde group

由圖5可見(jiàn)，不同濃度(0、0.1、1和10 mmol·L-1)NAC預(yù)處理1 h，再以200 μmol·L-1甲醛處理BEAS-2B細(xì)胞24 h，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)計(jì)算細(xì)胞存活率，1、10 mmol·L-1NAC預(yù)處理1 h組細(xì)胞存活率分別為68.94%±4.76%、104.10%±5.03%，與未用NAC預(yù)處理組比較細(xì)胞存活率均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p <0.05)。10 mmol·L-1NAC預(yù)處理組與正常培養(yǎng)組細(xì)胞存活率已無(wú)明顯差異(p >0.05)，NAC對(duì)甲醛誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞損傷的保護(hù)作用存在劑量效應(yīng)關(guān)系。

由圖6可見(jiàn)，預(yù)先3 h加入NAC再以NAC+甲醛處理、預(yù)先1 h加入NAC再以NAC+甲醛處理、同時(shí)加入甲醛和NAC及加入甲醛1 h后再以NAC+甲醛處理、加入甲醛3 h后再以NAC+甲醛處理，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)計(jì)算BEAS-2B細(xì)胞存活率，NAC預(yù)處理、同時(shí)加入甲醛和NAC及NAC后處理組細(xì)胞存活率與甲醛組比較細(xì)胞存活率均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，但NAC預(yù)處理、同時(shí)加入甲醛和NAC及NAC后處理各組之間細(xì)胞存活率無(wú)明顯差異(p>0.05)，說(shuō)明預(yù)先3 h加入NAC、預(yù)先1 h加入NAC、同時(shí)加入甲醛和NAC及加入甲醛1 h后再加入NAC、加入甲醛3 h后再加入NAC均對(duì)甲醛誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞損傷具有保護(hù)效應(yīng)。

3 討論(Discussion)

Persoz等[32]通過(guò)研究肺泡上皮細(xì)胞A549和支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B甲醛暴露24 h后炎癥因子白介素-8(interleukin 8, IL-8)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein 1, MCP-1)的變化，發(fā)現(xiàn)甲醛可能加重嚴(yán)重哮喘呼吸道的炎癥反應(yīng)，甚至可和其他空氣污染物如變應(yīng)原起協(xié)同效果。甲醛還能以劑量依賴(lài)性方式誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞A549細(xì)胞凋亡，機(jī)制可能是甲醛通過(guò)激活p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)信號(hào)通路而下調(diào)重要的內(nèi)源性抗氧化分子過(guò)氧化物酶2(peroxiredoxin 2, Prx 2)表達(dá)[33]。CCK-8實(shí)驗(yàn)是一種基于可溶性噻唑鹽WST-8而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的檢測(cè)，具有快速、高靈敏度的特點(diǎn)，原理是WST-8在電子耦合試劑存在的情況下，可被線(xiàn)粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的Formazan。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值即可檢測(cè)細(xì)胞增殖的快慢和對(duì)細(xì)胞毒性的高低。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同濃度(50～400 μmol·L-1)的甲醛處理人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B，CCK-8實(shí)驗(yàn)和倒置相差顯微鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)50、100 μmol·L-1甲醛處理BEAS-2B細(xì)胞24 h細(xì)胞存活率下降，150、200 μmol·L-1甲醛處理BEAS-2B細(xì)胞存活率持續(xù)下降，繼續(xù)增加濃度至300、400 μmol·L-1甲醛可使BEAS-2B細(xì)胞死亡進(jìn)一步加重，說(shuō)明甲醛可以濃度依賴(lài)性方式引起支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B損傷。繪制細(xì)胞存活曲線(xiàn)后利用SPSS18.0軟件以細(xì)胞存活率對(duì)劑量作圖，可得甲醛的半數(shù)抑制濃度IC50為146.15 μmol·L-1，可為甲醛毒性實(shí)驗(yàn)提供參考。通過(guò)CCK-8檢測(cè)甲醛處理不同時(shí)間對(duì)支氣管上皮存活率的影響，結(jié)果顯示，48 h內(nèi)隨甲醛處理時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞存活率明顯下降，BEAS-2B細(xì)胞存活率與甲醛處理時(shí)間存在時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。甲醛可以劑量和時(shí)間依賴(lài)性方式引起支氣管上皮細(xì)胞存活率下降，具體機(jī)制有待下一步實(shí)驗(yàn)研究。

圖5 不同濃度NAC對(duì)甲醛致BEAS-2B細(xì)胞損傷的保護(hù)作用注：*: p<0.05，與對(duì)照組比較，a、b和c: p<0.05，分別與0、0.1和1 mmol·L-1 NAC組比較Fig. 5 The protective effect of NAC at different concentrations on formaldehyde-induced BEAS-2B cells damageNote: *: p<0.05, compared with the control group，a, b and c: p<0.05，compared with the NAC group at 0, 0.1 and 1 mmol·L-1 respectively

圖6 NAC不同時(shí)間對(duì)甲醛致BEAS-2B細(xì)胞損傷的保護(hù)作用注：*: p<0.05，與對(duì)照組比較，a: p<0.05，與甲醛組比較。Fig. 6 The protective effect of NAC at different times on formaldehyde-induced BEAS-2B cells damageNote: *: p<0.05, compared with the control group，a: p<0.05，compared with the formaldehyde(FA) group.

NAC是天然存在的氨基酸L-半胱氨酸乙?；难苌?，已被廣泛應(yīng)用于臨床[19]，并可能通過(guò)多種機(jī)制對(duì)甲醛誘導(dǎo)的肺損傷有保護(hù)作用[34]。國(guó)內(nèi)外研究表明，NAC可抑制甲醛誘導(dǎo)的單核細(xì)胞還原型/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)比率減少，拮抗其p38 MAPK磷酸化[35]。NAC對(duì)甲醛誘導(dǎo)的NIH3T3細(xì)胞[27]、成骨細(xì)胞[28]損傷也具有保護(hù)作用。NAC預(yù)處理能顯著逆轉(zhuǎn)甲醛引起的T細(xì)胞γ-干擾素減少和DNA損傷誘導(dǎo)基因45α和糖皮質(zhì)激素亮氨酸拉鏈基因mRNA表達(dá)增加[36]。馮丫娟等[30-31]研究發(fā)現(xiàn)NAC對(duì)甲醛引起的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降也有保護(hù)作用。因此，推測(cè)NAC可能對(duì)甲醛誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞損傷也具有保護(hù)作用。我們首先通過(guò)倒置顯微鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，200 μmol·L-1甲醛處理24 h 可引起B(yǎng)EAS-2B細(xì)胞大量細(xì)胞死亡，加入1 mmol·L-1NAC預(yù)處理1 h可顯著減少甲醛誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞死亡，說(shuō)明NAC對(duì)甲醛誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞損傷具有保護(hù)效應(yīng)。接著，通過(guò)CCK-8檢測(cè)不同濃度NAC預(yù)處理或不同時(shí)間NAC處理對(duì)甲醛致BEAS-2B細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果顯示NAC可以劑量依賴(lài)性方式對(duì)甲醛引起的BEAS-2B細(xì)胞損傷具有保護(hù)效應(yīng)，預(yù)先3、1 h、同時(shí)加入及200 μmol·L-1甲醛處理1、3 h后再加入NAC均可拮抗甲醛引起的BEAS-2B細(xì)胞存活率下降(雖然NAC不同時(shí)間處理組間細(xì)胞存活率未見(jiàn)明顯差異)，為NAC可能在將來(lái)作為一種具有臨床開(kāi)發(fā)前景的治療甲醛誘導(dǎo)呼吸道上皮損傷的藥物提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，下一步將研究NAC對(duì)甲醛致支氣管上皮細(xì)胞損傷保護(hù)效應(yīng)的分子機(jī)制，為甲醛對(duì)呼吸道上皮損傷的評(píng)價(jià)及制訂有效防治措施提供參考。

[1] Kim K H, Jahan S A, Lee J T. Exposure to formaldehyde and its potential human health hazards [J]. Journal of Environmental Science and Health. Part C, Environmental Carcinogenesis & Ecotoxicology Reviews, 2011, 29(4): 277-299

[2] 肖存杰, 王騰蛟, 劉洪林, 等. 潛艇大氣組分的研究[J]. 解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2003, 21(1): 16-18

Xiao C J, Wang T J, Liu H L, et al. Study on air composition of submarine chambers [J]. Journal of Preventive Medicine of Chinese People's Liberation Army, 2003, 21(1): 16-18 (in Chinese)

[3] 李崇磊, 王凡, 劉薇, 等. 甲醛及苯系物混合暴露對(duì)小鼠肺臟的氧化損傷作用[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2012, 7(1): 87-92

Li C L, Wang F, Liu W, et al. Oxidative damage induced by formaldehyde and benzene series inhalation on mice lung [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2012, 7(1): 87-92 (in Chinese)

[4] 問(wèn)華肖, 魏晨曦, 陳紹恢, 等. 苯和甲醛聯(lián)合染毒對(duì)小鼠脾臟的損傷[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2013, 8(4): 571-576

Wen H X, Wei C X, Chen S H, et al. Spleen tissue damage in mice from combined exposure of benzene and formaldehyde [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2013, 8(4): 571-576 (in Chinese)

[5] Tang X, Bai Y, Duong A, et al. Formaldehyde in China: Production, consumption, exposure levels, and health effects [J]. Environment International, 2009, 35(8): 1210-1224

[6] 歐超燕, 孔璐, 趙進(jìn)順. 苯、甲醛對(duì)原代大鼠肺成纖維細(xì)胞聯(lián)合毒性作用的初步探討[J]. 中國(guó)職業(yè)醫(yī)學(xué), 2009, 36(4): 338-339

Ou C Y, Kong L, Zhao J S. Joint action for cytotoxicity of benzene and formaldehyde on cultured rat lung fibroblast cells [J]. China Occupational Medicine, 2009, 36(4): 338-339 (in Chinese)

[7] 于光艷, 宋祥福, 栗學(xué)軍. 甲醛對(duì)小鼠肺組織形態(tài)及肺泡灌洗液成分的影響[J]. 中國(guó)工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 20(6): 404-405

Yu G Y, Song X F, Li X J. Effects of formaldehyde on lung histomorphology and BALF components of mice [J]. Chinese Journal of Industrial Medicine, 2007, 20(6): 404-405 (in Chinese)

[8] 趙暉, 王地, 于萍, 等. 既有建筑環(huán)境中甲醛濃度對(duì)小鼠肺組織及炎性細(xì)胞因子的作用[J]. 建筑科學(xué), 2012, 28(1): 37-41

Zhao H, Wang D, Yu P, et al. Effects of the existing building environment of formaldehyde on the histopathology and expression of inflammatory cytokines in the lung tissue of mice [J]. Building Science, 2012, 28(1): 37-41 (in Chinese)

[9] 楊玉花, 襲著革, 晁福寰, 等. 氣態(tài)甲醛對(duì)大鼠肺組織影響的病理學(xué)觀(guān)察[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2007, 2(3): 310-314

Yang Y H, Xi Z G, Chao F H, et al. Pathological effects of formaldehyde inhalation on lung of rats[J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2007, 2(3): 310-314 (in Chinese)

[10] 金美花, 蘇立明, 池永學(xué), 等. 甲醛暴露對(duì)哮喘大鼠氣道反應(yīng)性及肺組織病理學(xué)改變影響[J]. 中國(guó)職業(yè)醫(yī)學(xué), 2011, 38(4): 306-308

Jin M H, Su L M, Chi Y X, et al. Effects of formaldehyde exposure on airway hyperresponsiveness and lung pathological changes in rat model of asthma [J]. China Occupational Medicine, 2011, 38(4): 306-308 (in Chinese)

[11] 梁志鋒, 林軍, 武黎黃英, 等. 甲醛吸入急性肺水腫大鼠心、肺、腦、肝和血清蛋白濃度及一氧化氮合酶活力變化[J]. 環(huán)境與健康雜志, 2009, 26(12): 1094-1096, 1145

Liang Z F, Lin J, Vule H A, et al. Changes of protein concentration (Cpro) and nitric oxide synthase (NOS) of serum, heart, lungs, brain and liver in acute pulmonary edema rats model induced by formaldehyde inhalation [J]. Journal of Environment and Health, 2009, 26(12): 1094-1096, 1145 (in Chinese)

[12] 洪志強(qiáng), 童智敏, 施健. 甲醛對(duì)作業(yè)工人呼吸系統(tǒng)及肺功能影響[J]. 中國(guó)公共衛(wèi)生, 2007, 23(7): 849-850

Hong Z Q, Tong Z M, Shi J. Effects of maldehyde on respiratory system and pulmonary function of workers [J]. Chinese Journal of Public Health, 2007, 23(7): 849-850 (in Chinese)

[13] Zhai L, Zhao J, Xu B, et al. Influence of indoor formaldehyde pollution on respiratory system health in the urban area of Shenyang, China [J]. African Health Sciences, 2013, 13(1): 137-143

[14] Mahboubi A, Koushik A, Siemiatycki J, et al. Assessment of the effect of occupational exposure to formaldehyde on the risk of lung cancer in two Canadian population-based case-control studies [J]. Scandinavian Journal of Work, Environment & Health, 2013, 39(4): 401-410

[15] 馮丫娟, 翟金霞. 甲醛對(duì)機(jī)體氧化損傷效應(yīng)影響的研究進(jìn)展[J]. 環(huán)境與健康雜志, 2008, 25(4): 364-366

Feng Y J, Zhai J X. Research advance on oxidation damage induced by formaldehyde[J]. Journal of Environment and Health, 2008, 25(4): 364-366 (in Chinese)

[16] 樊冬梅, 謝華. 甲醛對(duì)呼吸系統(tǒng)毒性作用的研究現(xiàn)狀[J]. 廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2009, 27(5): 584-586, 591

Fan D M, Xie H. Current status of research on toxic effects of formaldehyde on the respiratory system [J]. Journal of Guangdong Medical College, 2009, 27(5): 584-586, 591 (in Chinese)

[17] Rager J E, Smeester L, Jaspers I, et al. Epigenetic changes induced by air toxics: formaldehyde exposure alters miRNA expression profiles in human lung cells [J]. Environmental Health Perspectives, 2011, 119(4): 494-500

[18] 楊淋清, 吳德生, 劉慶成, 等. 長(zhǎng)期低劑量甲醛染毒對(duì)永生化人支氣管上皮細(xì)胞株細(xì)胞 16HBE部分癌癥相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的影響[J]. 中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志, 2013, 27(3): 335-340

Yang L Q, Wu D S, Liu Q C, et al. Effect of long term contamination of low dose formaldehyde on methylation pattern of promoter of cancer related genes in 16HBE cells [J]. Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology, 2013, 27(3): 32-37 (in Chinese)

[19] Millea P J. N-acetylcysteine: Multiple clinical applications [J]. American Family Physician, 2009, 80(3): 265-269

[20] Kelly G S. Clinical applications of N-acetylcysteine [J]. Alternative Medicine Review: A Journal of Clinical Therapeutic, 1998, 3(2): 114-127

[21] 魏琳琳, 段鐘平. N-乙酰半胱氨酸藥物作用機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2008, 43(12): 887-889

Wei L L, Duan Z P. Progress in experimental research on mechanisms of drug action of N-acetylcysteine [J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2008, 43(12): 887-889 (in Chinese)

[22] Zafarullah M, Li W Q, Sylvester J, et al. Molecular mechanisms of N-acetylcysteine actions [J]. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS, 2003, 60(1): 6-20

[23] Wu Y J, Muldoon L L, Neuwelt E A. The chemoprotective agent N-acetylcysteine blocks cisplatin-induced apoptosis through caspase signaling pathway [J]. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2005, 312(2): 424-431

[24] Demiralay R, Gursan N, Erdem H. The effects of erdosteine, N-acetylcysteine, and vitamin E on nicotine-induced apoptosis of pulmonary cells [J]. Toxicology, 2006, 219(1-3): 197-207

[25] Demiralay R, Gursan N, Ozbilim G, et al. Comparison of the effects of erdosteine and N-acetylcysteine on apoptosis regulation in endotoxin-induced acute lung injury [J]. Journal of Applied Toxicology: JAT, 2006, 26(4): 301-308

[26] Hoshino Y, Mio T, Nagai S, et al. Cytotoxic effects of cigarette smoke extract on an alveolar type II cell-derived cell line [J]. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology, 2001, 281(2): L509-516

[27] Ayaki H, Lee M J, Sumino K, et al. Different cytoprotective effect of antioxidants and change in the iron regulatory system in rodent cells exposed to paraquat or formaldehyde [J]. Toxicology, 2005, 208(1): 73-79

[28] Huang F M, Chou L S, Chou M Y, et al. Protective effect of NAC on formaldehyde-containing-ZOE-based root-canal-sealers-induced cyclooxygenase-2 expression and cytotoxicity in human osteoblastic cells [J]. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials, 2005, 74(2): 768-773

[29] Bruchhausen S, Zahn S, Valk E, et al. Thiol antioxidants block the activation of antigen-presenting cells by contact sensitizers [J]. The Journal of Investigative Dermatology, 2003, 121(5): 1039-1044

[30] 馮丫娟, 丁書(shū)姝, 翟金霞. N-乙酰半胱氨酸對(duì)甲醛致小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降的拮抗作用[J]. 環(huán)境與健康雜志, 2008, 25(8): 680-683

Feng Y J, Ding S S, Zhai J X. Learning and memory damage induced by formaldehyde and protective efect of N-acetyl-cysteine in mice [J]. Journal of Environment and Health, 2008, 25(8): 680-683 (in Chinese)

[31] 翟金霞, 馮丫娟, 丁書(shū)姝. 維生素E和N-乙酰半胱氨酸對(duì)甲醛所致小鼠學(xué)習(xí)記憶能力改變的影響[J]. 中國(guó)職業(yè)醫(yī)學(xué), 2008, 35(6): 471-474

Zhai J X, Feng Y J, Ding S S. Effects of vitamin E and N-acetyl-cysteine on learning and memory ability impairment induced by formaldehyde in mice [J]. China Occupational Medicine, 2008, 35(6): 471-474 (in Chinese)

[32] Persoz C, Achard S, Momas I, et al. Inflammatory response modulation of airway epithelial cells exposed to formaldehyde [J]. Toxicology Letters, 2012, 211(2): 159-163

[33] Lim S K, Kim J C, Moon C J, et al. Formaldehyde induces apoptosis through decreased Prx 2 via p38 MAPK in lung epithelial cells [J]. Toxicology, 2010, 271(3): 100-106

[34] Wang M K, Chen S H, Ba J B, et al. Multiple mechanisms of N-acetylcysteine against formaldehyde-induced lung injury [J]. Medical Hypotheses, 2013, 81(1): 146-147

[35] Mizuashi M, Ohtani T, Nakagawa S, et al. Redox imbalance induced by contact sensitizers triggers the maturation of dendritic cells [J]. The Journal of Investigative Dermatology, 2005, 124(3): 579-586

[36] Sasaki Y, Ohtani T, Ito Y, et al. Molecular events in human T cells treated with diesel exhaust particles or formaldehyde that underlie their diminished interferon-gamma and interleukin-10 production [J]. International Archives of Allergy and Immunology, 2009, 148(3): 239-250

◆

ProtectiveEffectofN-acetylcysteineonFormaldehyde-inducedDamageinHumanBronchialEpithelialCells

Wang Mingke1,2, Chen Shuanghong1, Pan Huxiang1, Ba Jianbo1, Tao Yonghua1，*

1. Naval Medical Research Institute, Shanghai 200433, China 2. No. 441 Hospital of PLA, Fuding 355200, China

22 July 2013accepted18 September 2013PublisheddateonCNKIdatabases:28 November 2013

To investigate the effect of formaldehyde on the cell viability of human bronchial epithelial cells (BEAS-2B)，and examine the protective effect of N-acetylcysteine(NAC), BEAS-2B cells were treated for 24 h by different concentrations (0, 50, 100, 150，200，300 and 400 μmol·L-1) of formaldehyde in different times(0, 6, 24 and 48 h) by 200 μmol·L-1formaldehyde. In order to study the effect of NAC on the formaldehyde-induced cell damage, BEAS-2B cells were pretreated with different concentrations (0, 0.1, 1 and 10 mmol L-1) of NAC for 1 h or treated for different times (pretreated with 3 and 1 h, simultaneous treated, posttreated with 1 and 3 h) by 1 mmol L-1NAC, and exposed to 200 μmol·L-1formaldehyde (all group treated by formaldehyde for 24 h). Cell viability was detected by cell counting kit-8(CCK-8) or under an inverted phase-contrast microscope. Results showed that formaldehyde can induce BEAS-2B cells death in a dose-dependent manner. After treated with 200 μmol·L-1formaldehyde for 6 h，the cell survival rate was significantly lower than that of the control group (p <0.05), and a time-dependent decline in survival of formaldehyde-treated cells was detected. NAC attenuated the decline in survival rate of BEAS-2B cells induced by formaldehyde at different concentrations in a dose-dependent manner, and had an antagonistic action on formaldehyde-induced cell damage at different times. Moreover, in our experiment no significant differences of cell viability were observed between the NAC groups at different times. Therefore, it is demonstrated that the viability of bronchial epithelial cells exposed to formaldehyde declines in a dose and time-dependent manner, and NAC has a protective effect in a dose-dependent manner.

formaldehyde; human bronchial epithelial cells; N-acetylcysteine; protective effect

總后勤部重點(diǎn)科研項(xiàng)目(BHJ12J004)；上海市衛(wèi)生局科研課題計(jì)劃資助項(xiàng)目(20124Y178)；中國(guó)博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013M542529)

王明科(1983-)，男，博士，研究方向?yàn)榄h(huán)境科學(xué)及干細(xì)胞，E-mail: mingkew@gmail.com

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: tyhsci@sina.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20130722002 優(yōu)先出版網(wǎng)址：www. cnki. net/kcms/detail/11.5470. x. 20131128.1458.001. html

2013-07-22錄用日期：2013-09-18 < class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間

時(shí)間：2013-11-28

1673-5897(2014)1-145-08

： X171.5

： A

陶永華(1964—)，男，理學(xué)碩士，研究員，主要研究方向?yàn)榄h(huán)境科學(xué)。

王明科, 陳雙紅, 潘滬湘, 等. 甲醛對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞的毒性及N-乙酰半胱氨酸的保護(hù)作用[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2014, 9(1): 145-152

Wang M K, Chen S H, Pan H X, et al. Protective effect of N-acetylcysteine on formaldehyde-induced damage in human bronchial epithelial cells [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(1): 145-152 (in Chinese)