姜丹，周建國，李娜，饒凱鋒，李曉，胡毅，馬梅

1. 河南師范大學化學化工學院，新鄉(xiāng) 453007 2. 中國科學院高能物理研究所核分析技術重點實驗室，納米生物效應與安全性重點實驗室，北京 100049 3. 河南師范大學環(huán)境學院，黃淮水環(huán)境與污染防治教育部重點實驗室，新鄉(xiāng) 453007 4. 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境水質學國家重點實驗室，北京 100085

有機磷酸酯對青?；【鶴67毒性的構效關系

姜丹1,2，周建國3,*，李娜2,4,#，饒凱鋒4，李曉4，胡毅2，馬梅4

1. 河南師范大學化學化工學院，新鄉(xiāng) 453007 2. 中國科學院高能物理研究所核分析技術重點實驗室，納米生物效應與安全性重點實驗室，北京 100049 3. 河南師范大學環(huán)境學院，黃淮水環(huán)境與污染防治教育部重點實驗室，新鄉(xiāng) 453007 4. 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境水質學國家重點實驗室，北京 100085

有機磷酸酯；發(fā)光菌；定量構效

有機磷酸酯類化合物(OP)不僅廣泛應用于農藥[1-2]，還被用于增塑劑、醫(yī)藥制劑、阻燃劑以及軍事工業(yè)等領域[3]。該類化合物的廣泛使用也帶來不可忽視的環(huán)境問題，一些有機磷酸酯類化合物易溶于水，一旦進入江河之中，可以很容易對水生生態(tài)系統(tǒng)造成污染，從而增大了水生動植物的敞口風險[4]。如今被人們利用的有機磷酸酯類化合物的種類較多，人們對其危害性也進行了一定的研究，前人多以研究有機磷酸酯類的農藥，例如敵敵畏、辛硫磷、久效磷和二嗪農等的急性毒性以及其對乙酰膽堿酯酶的抑制作用為主[5-7]。但是，應用于其他行業(yè)的有機磷酸酯類化合物的毒性報道較少，例如應用較多的用于阻燃劑的磷酸三甲酯、磷酸三乙酯、磷酸三丙酯、磷酸三甲苯酯等。有機磷酸酯是以添加方式加到材料中的，這使其進入水生態(tài)環(huán)境的幾率增大[8]。例如，污水處理工藝中，由于使用的塑料制品含有大量有機磷酸酯，其可在水流的作用下釋放，使出水口有機磷酸酯的濃度提高[9]。韓國和澳大利亞等國家在污水處理廠也檢出了有機磷酸酯[10-11]。目前，我國關于非農藥類的有機磷酸酯的研究主要還是集中在合成和使用方面，而關于其對水生態(tài)環(huán)境的污染研究仍然較少，因此，亟需對有機磷酸酯進行水生生物的毒性研究。

有機磷酸酯類化合物種類較多，通過對有機磷酸酯的毒性效應進行檢測并構建定量構效關系模型(quantitative structure-activity relationships，QSAR)，可以對其進行毒性預測及機理解釋。目前，利用QSAR來分析毒性實驗結果并對同類物質的毒性進行預測，已是毒理學研究的領域中很重要的分析方法，可用于研究污染物生態(tài)毒理效應及環(huán)境行為與分子結構的內在關聯(lián)，也可降低實驗的費用，并且機理明確的QSAR 有助于對實驗數據不確定性進行評價。

本研究選用發(fā)光菌中的青?；【鶴67(Vibrio qinghaiensis sp. -Q67)來檢測所選用樣品的毒性。發(fā)光細菌生物毒性測試法由于反應快速、靈敏度高和經濟等優(yōu)點得到廣泛關注[12]。正常的生理活性條件下，發(fā)光細菌可發(fā)出肉眼可見的藍綠色光[13]。當外界環(huán)境發(fā)生變化或存在污染物干擾時均能使發(fā)光細菌的發(fā)光強度變化，其發(fā)光強弱與毒性物質的濃度成一定比例關系[14]。青?；【鶴67是一種淡水發(fā)光菌[15]，該發(fā)光菌能在淡水中發(fā)光，對鹽離子的濃度要求不高，可廣泛應用到環(huán)境污染監(jiān)測中，在淡水污染物毒性評價中的優(yōu)勢明顯[15-16]。許多國內研究者利用青?；【鶴67對取代酚類[16-17]、重金屬[18]等環(huán)境污染物進行了急性毒性的研究，已取得較好的效果。本研究所采用的建模方法為偏最小二乘(partial least square regression，PLS)回歸分析方法[19]，該方法更容易識別噪聲與系統(tǒng)信息，可將多個因變量同時進行建模，并且在樣本的容量少于變量的個數時也可回歸建模[20]。

本研究選擇了15種常見有機磷酸酯類化合物作為研究對象，結合微孔板高通量檢測技術，研究了有機磷酸酯類化合物對青海弧菌Q67的毒性，同時采用偏最小二乘方法構建QSAR模型并對其可能的毒性機制進行解釋。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 主要儀器和試劑

儀器：Infinite M200 酶標儀(TECAN)、恒溫振蕩搖床(HZQ-F，哈東聯(lián))、恒溫平板搖床(Titramax 1000，Heidolph，Germany)、百級超凈工作臺(DL-CJ-1F，哈東聯(lián))、旋渦混合器(MS2，廣州 IKAWorks)。

試劑：15種有機磷酸酯類化合物均購自美國 Sigma-Aldrich 公司，化合物的結構和純度見表1。

表1 15種常見有機磷酸酯的結構Table 1 The parameters of 15 organophosphates

1.2 實驗菌種

本實驗選用的青?；【鶴67由華東師范大學惠贈，在生態(tài)環(huán)境研究中心長期保存并選育，測試方法參見相關文獻[21]。

1.3 分子結構描述符

本研究采用PLS進行回歸建模，選用了最低空軌道能級(LUMO，eV)、極化率(P)、正辛醇/水分配系數(logD)、芳香環(huán)個數(NAr)、氫鍵受體個數(NA)、氫鍵供體個數(ND)和分子表面積(TSA)等七種分子結構描述符為QSAR研究的因子，七種分子結構描述符均由Gaussian 03[22]軟件計算得到。15 種有機磷酸酯的分子結構描述符見表 2。

1.4 有機磷酸酯類對Q67發(fā)光菌的毒性測試

有機磷酸酯類對Q67發(fā)光菌的毒性測試參照文獻[21,23-24]實驗方法進行。取低溫條件下保存的Q67 菌種轉入新鮮的斜面上，22 ℃ 條件下恒溫培養(yǎng) 24 h，然后將菌種接入裝有液體培養(yǎng)基的錐形瓶內，于22 ℃條件下，振蕩(180 r·min-1)培養(yǎng)16～18 h，2000 r·min-1下離心10 min，收集菌體，用模擬湖水將菌體制成菌懸液。調整菌懸液的密度，使其發(fā)光強度在200～600萬RLU之間，待用。實驗前，用人工配置的實驗溶液(模擬湖水，化學組成接近天然湖水)稀釋樣品所對應的12個幾何級數濃度梯度，將其加入96孔微板中，模擬湖水設為空白對照，樣品的每個濃度設置3個平行。震蕩20 min后，用酶標儀測定各孔的發(fā)光強度(RLU)，以空白對照的 RLU的均值(I0)和各濃度的3個平行樣的 RLU的均值(I)計算樣品對發(fā)光菌發(fā)光的相對抑制率x(%)，每塊板重復3次以減少隨機誤差。其中，x(%)=(1-I/I0)×100%模擬湖水配方：4.2 mg KCl、11.1 mg CaCl2、28.6 mg MgSO4、42.0 mg NaHCO3、4.2 g NaNO3溶于1 L蒸餾水，121 ℃條件下高壓滅菌20 min。

2 結果(Results)

2.1 15種常見有機磷酸酯對Q67發(fā)光菌的毒性

根據Q67發(fā)光菌的毒性數據，分別用OriginPro 8擬合了15種有機磷酸酯與Q67發(fā)光菌的劑量-效應關系，如圖1。依據擬合的劑量-效應曲線，可以得到15種有機磷酸酯的EC50、EC20以及相關系數(r)，結果見表3。從表3中可以看出，有機磷酸酯的EC50在1.13×10-5～3.27×10-3mol·L-1之間。

表2 有機磷酸酯類化合物的分子結構描述符Table 2 Molecular descriptors of organophosphates

表3 15種常見有機磷酸酯的logistic函數擬合結果Table 3 Fitting results of logistic functions for 15 organophosphates

圖1 15種常見有機磷酸酯的劑量-效應曲線Fig. 1 Dose-response curves for 15 organophosphates

2.2 15種磷酸酯類化合物對Q67發(fā)光菌毒性的QSAR研究

從15種有機磷酸酯類化合物中隨機選取12種組成訓練集，其余3種作為驗證集，將訓練集中的12種機磷酸酯類化合物的-logEC50值作為因變量，運用軟件SIMCA-P 6.0中的PLS創(chuàng)建模型[25]，主成分分析結果如表4。其中，最優(yōu)模型如下：

-logEC50=2.979+0.246P+0.220logD+0.204NAr+0.186TSA-0.129LUMO-0.084NA+0.080 ND

表4 QSAR模型得到的有機磷酸酯-logEC50的實測值與預測值Table 4 Observed and predicted values of -logEC50 for organophosphates from QSAR model

注：* 驗證集中的化合物。 Note: * compounds for validation set.

圖2 15種常見有機磷酸酯-logEC50的實測值與預測值的擬合圖Fig. 2 Plot of observed against predicted -logEC50 values for 15 organophosphates

3 討論(Discussion)

3.1 污染物對Q67發(fā)光菌的致毒機制

有報道稱[26]，污染物對發(fā)光菌的毒性效應主要有兩個途徑決定：(1)參與發(fā)光反應的酶類活性；(2)生物代謝的過程。而有機磷酸酯類化合物作為反應性有機化合物，其分子活性中心可對發(fā)光菌中的熒光素酶及其輔酶作用產生毒性效應，林志芬[27]通過實驗也驗證了發(fā)光菌體內污染物的毒性是由污染物的活性中心作用于發(fā)光菌中的熒光素酶及其輔酶而產生，而不是作用于其他生物大分子。黃素單

核苷酸在發(fā)光菌發(fā)光的過程中起著重要的輔酶作用，而且其還原形式(FMNH2)中的-NH和-OH基團都在暴露位點，污染物通過脂溶作用在發(fā)光菌的細胞類脂蛋白膜上聚集后，還可再通過分子中的-NO2、-OH和-NH2等氫鍵的給予體或接受體與黃素單核苷酸的還原形式(FMNH2)結合產生氫鍵進一步增大污染物對Q67發(fā)光菌的急性毒性效應[28]。雖然污染物可通過脂溶性在細胞類脂蛋白膜上聚集，但是洪暉等人[29]推測，對于單細胞微生物的發(fā)光菌，其含有較少的類脂，因此污染物的脂溶性不能決定其對發(fā)光菌毒性的大小，而是由污染物的活性中心作用于發(fā)光菌中的酶來決定。蘇麗敏[30]也認為污染物的脂溶性對發(fā)光菌的急性毒性效應貢獻較小。

3.2 有機磷酸酯類化合物的構效關系分析

本研究中的模型引入的主成分及預測變量分別為1個和7個，如表5所示。可以看出PLS 主成分在P、logD、NAr、TSA上的載荷值比較大，該4個變量的投影性指標，即VIP值較大，表明對-logEC50值的影響顯著。

由最優(yōu)模型回歸系數及表5可知，P、logD、NAr和TSA對PLS的主成分貢獻大，并且與-logEC50值成正相關關系。而LUMO、NA和ND也有一定程度的貢獻。

分子極化率P，是對電介質的極化特性進行描述的微觀參數。P值越大，越容易產生范德華力。Wang等人[31]利用QSAR模型研究了苯砜基環(huán)烷酸酯類化合物對明亮發(fā)光桿菌的毒性效應，研究表明，P值越大，苯砜基環(huán)烷酸酯類化合物的毒性越強。蘇麗敏[28]通過QSAR建模的研究表明，分子中含有基團(如-Cl、-OR等)的電負性越強并且越多時，化合物的P值越大，越容易與受體蛋白分子產生分子間作用力，并且隨作用力的增強，對受體的毒性越大。這可以很好地解釋本實驗研究的有機磷酸酯類化合物，當其取代基的電負性基團越多電子云密度越大時，中心原子給電子能力增強，對Q67發(fā)光菌的毒性效應越大。由本實驗研究測試的磷酸酯類化合物的-logEC50值知，磷酸三甲酯、磷酸三乙酯、磷酸三丙酯和磷酸三丁酯4種有機磷酸酯化合物隨著P值的增大，對Q67發(fā)光菌的急性毒性效應也就越強。含有羥基的磷酸二丁酯和雙(2-乙基己基)磷酸酯對Q67發(fā)光菌的急性毒性效應大小也與P值正相關。對于亞磷酸酯類化合物，結構相似的亞磷酸三丁酯、三異丙基亞磷酸酯和亞磷酸二芐酯、亞磷酸二苯酯對Q67發(fā)光菌的急性毒性效應隨P值的增大而增強，與實驗測試結果一致。含有苯環(huán)結構的亞磷酸三苯酯和亞磷酸二苯酯對Q67發(fā)光菌的急性毒性效應大小也與P值正相關。而鹵素取代的2-溴乙基磷酸二乙酯由于-Br的存在，可使P值增大，其急性毒性效應大于與其結構、組成相似的磷酸三乙酯。因此，本研究證明分子極化率P在有機磷酸酯類污染物對發(fā)光菌的急性毒性中發(fā)揮重要作用。

表5 變量在QSAR模型中的VIP及PLS權重Table 5 VIP and PLS weights of variable for QSAR model

注：W*1為權重；VIP為投影性指標。

Note: W*1, PLS weights; VIP, values of the variable importance in the projection.

正辛醇/水分配系數logD，是疏水性參數，為化合物在正辛醇相與水相的濃度之比?？煞从郴衔锏闹苄源笮32]，其可影響細胞膜對化合物的吸附、累積及界面?zhèn)鬏數倪^程，同時也會影響化合物與酶蛋白的結合。logD越大，化合物的脂溶性越大，越較易穿過細胞膜，進而使Q67發(fā)光菌的毒性效應增大。本研究中結構非常相近的磷酸三甲酯、磷酸三乙酯、磷酸三丙酯與磷酸三丁酯隨著logD的增大其對發(fā)光菌的急性毒性也隨之增大。對于含有羥基的磷酸二丁酯和雙(2-乙基己基)磷酸酯，雙(2-乙基己基)磷酸酯的logD高于磷酸二丁酯，對Q67發(fā)光菌的急性毒性效應也強。亞磷酸酯類化合物中，亞磷酸三丁酯的logD值大于三異丙基亞磷酸酯，其對Q67的急性毒性效應也就越大。由此可看出，對于發(fā)光菌，盡管其含有較少的類脂，但是污染物的脂溶性對發(fā)光菌的急性毒性效應也有一定貢獻。林志芬等人[27]的實驗也驗證了脂溶性對發(fā)光菌的急性毒性效應有一定貢獻。這點與蘇麗敏[30]、洪暉等人[29]的觀點有所不同， 還有待進一步的實驗證明。

芳香環(huán)個數NAr，是化合物中含有的芳香環(huán)數目，鄒立和汝少國等人[33-34]認為含有苯環(huán)結構的有機磷酸酯的毒性強，其他取代基與苯環(huán)形成的離域大π鍵越大，電子云密度越大，苯環(huán)結構越穩(wěn)定，有機磷酸酯的毒性也就越強。本研究也發(fā)現芳香環(huán)數越多，有機磷酸酯對發(fā)光菌的急性毒性越大。如亞磷酸酯類化合物中的亞磷酸三丁酯、亞磷酸二苯酯和亞磷酸三苯酯對Q67發(fā)光菌的急性毒性效應隨著苯環(huán)個數的增多而增強。磷酸三苯酯對Q67發(fā)光菌的急性毒性效應大于其他幾種只含有脂肪鏈的磷酸酯類化合物的結果也說明了苯環(huán)結構的存在對毒性效應影響顯著。

分子表面積TSA，是QSAR研究中的一個重要描述變量，與正辛醇/水分配系數有很好的相關性，TSA越大，越容易與生物體接觸進入細胞體內，對Q67發(fā)光菌的急性毒性效應就越強，這與Wilson等人[35]研究的四十多種化合物的毒性結果相一致。本實驗研究測試的磷酸三甲酯、磷酸三乙酯、磷酸三丙酯和磷酸三丁酯四種有機磷酸酯化合物隨著TSA值的增大，對Q67發(fā)光菌的急性毒性效應也就越強。含有羥基的磷酸二丁酯和雙(2-乙基己基)磷酸酯對Q67發(fā)光菌的急性毒性效應大小也與TSA值正相關。對于亞磷酸酯類化合物中結構相似的亞磷酸三丁酯、三異丙基亞磷酸酯和亞磷酸二芐酯、亞磷酸二苯酯，其對Q67發(fā)光菌的毒性效應隨TSA值的增大而增強，與實驗測試結果一致。

分子的最低空軌道能LUMO，是電性參數，為能級最低且未占有電子的軌道，韓香云認為[36]LUMO越小，含硫芳香羧酸酯衍生物對發(fā)光菌的毒性越大，LUMO與化合物的電子親和能相關，LUMO越小，分子越較易接受電子，并與親核試劑發(fā)生反應，最終導致毒性增強，本研究也證實了有機磷酸酯的毒性與LUMO成反比。NA和ND分別反映化合物分子同其他基團形成氫鍵時所能接受或給出質子氫的個數，NA和ND越多，與發(fā)光菌受體中的-OH、-NH或=O、O-等越易于形成氫鍵而增強化合物的毒性，而本研究結果表明NA和ND對有機磷酸酯的毒性有一定的貢獻。

綜上所述，本研究所檢測的有機磷酸酯類化合物均對Q67發(fā)光菌有急性毒性效應。結合QSAR研究發(fā)現，P、TSA、logD和NAr對有機磷酸酯的急性毒性的貢獻較大，且與毒性(-logEC50)正相關。對于結構、組成相似并且只含有脂肪鏈的磷酸酯和亞磷酸酯化合物，P、TSA和logD值越大，其對Q67發(fā)光菌的急性毒性效應也越強。含有苯環(huán)結構的磷酸酯和亞磷酸酯化合物，芳香環(huán)NAr個數越多對Q67發(fā)光菌的急性毒性效應也就越強。鹵取代有機磷酸酯化合物，由于鹵素的電負性較強，增加了化合物的P值，即鹵素的存在使污染物對Q67發(fā)光菌的急性毒性效應增強。利用偏最小二乘方法對有機磷酸酯類急性毒性構建的QSAR 模型預測能力較好、穩(wěn)定性較高，并且無過擬合的現象，能用來預測有機磷酸酯對Q67發(fā)光菌的毒性效應。

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QuantitativeStructure-ActivityRelationshipsbetweenAcuteToxicityofOrganophosphatesandVibrioqinghaiensissp. -Q67

Jiang Dan1,2, Zhou Jianguo3,*, Li Na2,4,#, Rao Kaifeng4, Li Xiao4, Hu Yi2, Ma Mei4

1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China 2. Key Laboratory for Biomedical Effects of Nanomaterials and Nanosafety, Multi-discipline Initiative Center, Institute of High Energy Physics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China 3. Key Laboratory of Yellow River and Huai River Water Environment and Pollution Control, Ministry of Education, College of Environment, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China 4. State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China

29 January 2013accepted18 April 2013

organophosphates; Vibrio qinghaiensis sp. -Q67; QSAR

國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃) 2012AA06A302；國家自然科學基金20871042；教育部高等學校博士學科點專項科研基金 20104104110004；河南省教育廳自然科學研究基金 2011A150019和2008B430012

姜丹(1985-)，女，碩士，研究方向：環(huán)境污染物對發(fā)光菌的急性毒性研究; E-mail: jiangdan.110@163.com；

*通訊作者(Corresponding author), E-mail: zhoujgwj@sina.com

10.7524/AJE.1673-5897.20130129001

2013-01-29錄用日期：2013-04-18

1673-5897(2014)1-071-10

： X171.5

： A

周建國(1963—)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事無機功能材料和環(huán)境化學研究。李娜(1982—)，女，博士，助研，主要從事環(huán)境毒理方面的研究。

#共同通訊作者(Co-corresponding author), E-mail: linazone@163.com

姜丹，周建國，李娜，等. 有機磷酸酯對青海弧菌Q67毒性的構效關系[J]. 生態(tài)毒理學報, 2014, 9(1): 71-80

Jiang D, Zhou J G, Li N, et al. Quantitative structure-activity relationships between acute toxicity of organophosphates and Vibrio qinghaiensis sp. -Q67 [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(1): 71-80 (in Chinese)