徐 磊，李思嘉，2，王 晟，韓小玉，韓博平＊＊

(1:暨南大學生態(tài)學系，廣州510632)

(2:珠江水資源保護科學研究所，廣州510611)(3:浙江省發(fā)展規(guī)劃研究院，杭州310012)

休眠是枝角類生活史的重要階段，枝角類可以通過有性生殖產生休眠卵，使種群進入休眠階段來應對水體環(huán)境的惡化，直到水體環(huán)境再度適合生存，休眠階段打破，種群得以補充和恢復［1－2］.類似于高等植物的土壤種子庫，大量由卵鞍包被的休眠卵周期性地沉入水體底部，形成一個具有世代周期重疊的休眠卵庫.在沉積物保存良好的水體中(深水水體)，卵庫中枝角類卵鞍種類組成或豐度的變化反映了群落結構的歷史動態(tài)，可以用來了解水體生態(tài)與人類影響的長期變化［3－4］.休眠卵的孵化為種群延緩提供種源的同時，不同時期的休眠卵所保存的遺傳特征在很大程度上影響著現(xiàn)生種群的遺傳多樣性.通過對休眠卵遺傳信息的研究，可以在時間尺度上了解種群遺傳結構的變化，重建種群動態(tài)的歷史變化過程和水體生態(tài)演變，探討水體環(huán)境變化與枝角類適應性.這種基于底泥中的休眠卵庫(egg bank)對生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)生的生態(tài)和進化過程的分析成為長期生態(tài)學和進化生態(tài)學研究的重要方法，Kerfoot等［5］稱之為重構生態(tài)學(reconstruction ecology).

溞屬(Daphnia)是淡水枝角類的主要類群，相對其它類群，其個體較大，繁殖速度快，有很強的濾食能力，在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著極其重要的功能.溞屬有性生殖形成的休眠卵被由幾丁質外殼構成的卵鞍所包被，可以在水體沉積物中保存較長時間仍然具有萌發(fā)活性，這使構建溞屬的歷史種群遺傳信息成為可能.Carvalho和Wolf［6－7］是最早通過孵化沉積物中的休眠卵研究水體浮游動物遺傳多樣性的學者.Weider等［8］通過等位酶技術研究Constance湖中溞屬休眠卵基因頻率的變化，發(fā)現(xiàn)等位酶PGI的基因頻率與水體富營養(yǎng)化有關.然而，他們的研究都基于將休眠卵孵化，培育出大量的克隆體，等位酶技術對實驗材料嚴格的要求使得研究難以深入.因此，直接從休眠卵中獲得遺傳信息顯得尤為重要，目前，國際上許多學者已經通過獲取卵庫中的遺傳信息，發(fā)現(xiàn)溞屬的遺傳結構與富營養(yǎng)化［9－10］、有毒藍藻水華［11－12］、漁業(yè)養(yǎng)殖［13］以及宿主寄生［14］有關.我國也有關于枝角類休眠卵的研究，但主要是有關休眠卵萌發(fā)和外形及分布特征的研究［15－17］，受休眠卵基因組DNA提取較為困難的限制，尚無對枝角類休眠卵遺傳信息的研究結果方面的報道.

目前國際上對于浮游動物DNA的提取主要采用HotSHOT法和相關改良方法［18－19］，但此類方法為了避免DNA在抽提過程中的損失，不涉及DNA純化過程，因此殘留的提取液以及動物殘體勢必會給后期的實驗研究帶來干擾.本文將嘗試使用氯仿異戊醇和玻璃乳法提取單個盔型溞(Daphnia galeata)休眠卵基因組的DNA，并對這2種方法進行比較研究，包括提取效率和隨后的PCR擴增檢測以及兩種方法的準確性驗證.

1 材料與方法

1.1 枝角類休眠卵的采集

盔型溞是我國淡水生態(tài)系統(tǒng)中廣泛分布的大型枝角類.本研究使用的盔型溞休眠卵采集于廣東省流溪河水庫，該水庫(23°45'N，113°46'E)是一座典型的貧中營養(yǎng)的深水水庫，正常水位時，水面面積12.25 km2，庫容3.25 ×108m3，平均水深26.53 m，最大水深73 m.

2010年7月，使用Uwitec柱狀采泥器(奧地利)在位于水庫敞水區(qū)的中間位置分別采集4～5柱保存較好的沉積物.采集到的沉積物分別切取表層0～10 cm部分以及底層30～40 cm部分(根據水庫沉積速率和休眠卵庫分布以及孵化的特征，沉積物表層10 cm約為近10年內積累的休眠卵，而沉積物底層30～40 cm代表水庫建成后10～20年內積累的休眠卵［4，20－21］)，為避免由于采泥器PVC柱子滑動造成不同泥層間的沉積物交叉污染，泥層外圍的沉積物切割后需要舍棄［22－23］.分層切割后的樣品分別用孔徑為600、200和35 μm的網篩依次過濾篩選，每個網篩過濾后殘留的液體轉移至100 ml塑料小白瓶中，保存于4℃冰箱中.分離出含有休眠卵的殘余液體在20～50倍放大的解剖鏡(Olympus SZX71)和顯微鏡(Olympus CX21)下進行觀察，挑取含有盔型溞休眠卵的卵鞍，并轉移至無水乙醇中－20℃保存.

1.2 氯仿異戊醇提取法

將單個卵鞍從無水乙醇中取出，用雙蒸水反復清洗3次以上，在解剖鏡下將休眠卵從卵鞍中剝離，然后轉移至離心管中，加人200 μl體積分數(shù)為10%的十二烷基硫酸鈉(SDS)消化液和 3 μl蛋白酶 K(20 mg/ml)，55℃水浴2 h后加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，12000轉/min離心10 min，取上清液，加入0.6倍至等體積異丙醇，12000轉/min冷凍離心5 min沉淀DNA，用體積分數(shù)為70%的乙醇清洗，干燥之后加入30 μl TE緩沖液溶解DNA，－20℃長期保存.

1.3 玻璃乳提取法

休眠卵基因組DNA提取使用Ultra－Sep Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒(美國Omega公司)中的幾種試劑，并對標準步驟進行調整，具體方法如下:將單個卵鞍從無水乙醇中取出，用雙蒸水反復清洗3次以上，在解剖鏡下將休眠卵從卵鞍中剝離，然后轉移至離心管中，加人200 μl體積分數(shù)為10%的SDS和3 μl蛋白酶K(20 mg/ml)，55℃水浴2 h后加入4 μl的玻璃乳和300 μl Binding buffer，12000轉/min離心3 min后棄上清液，加入300 μl Washing buffer與沉淀混合，12000轉/min離心3 min后棄上清液保留沉淀，放置室溫下晾干后，加入30 μl Elution buffer混勻，12000轉/min離心2 min，吸取上清液轉至新管，－20℃長期保存.

1.4 DNA濃度檢測與PCR擴增檢測

分別使用兩種方法提取表層和底層休眠卵基因組DNA各20個，通過核酸分析儀(Eppendorf Biophotometer Plus)檢測濃度和純度，統(tǒng)計提取效率.為進一步檢測DNA提取的成功率，使用線粒體細胞色素氧化酶I(COI)基因引物進行 PCR(BIO－RAD C1000 Thermal Cycler)擴增.COI引物為 LCO1490(GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG)和 HCO2198(TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA)［24］.擴增反應總體積為 30 μl，包括:3 μl 10 × buffer、1.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、引物各0.5 μmol/L、0.5 U Taq 酶(TaKaRa)和3 μl模板DNA.擴增程序為94℃預變性4 min，94℃變性1 min，50℃退火1.5 min，72℃延伸1 min，重復40次循環(huán)72℃延伸10 min，4℃結束反應.PCR完成后，取2 μl產物用于1%的瓊脂糖凝膠檢測，并在凝膠成像系統(tǒng)(BIO－RAD Universal Hood II)中觀察記錄結果.

2 結果

圖1 流溪河水庫沉積物中盔型溞含休眠卵的卵鞍形態(tài)Fig.1 Morphology of ephippium of Daphnia galeata isolated from sediments of Liuxihe Reservoir

從沉積物中獲得的盔型溞休眠卵如圖1所示，共對40個表層休眠卵進行DNA提取，氯仿異戊醇提取法成功提取8個，玻璃乳提取法成功提取15個，而40個底層休眠卵DNA提取中，氯仿異戊醇提取法僅成功提取3個，玻璃乳提取法成功提取11個.通過核酸分析儀檢測濃度和純度，玻璃乳提取法提取到的休眠卵基因組DNA平均濃度為28.37 ±2.56 ng/μl，要極顯著高于氯仿異戊醇提取法(P＜0.001，圖2a).玻璃乳提取法提取 DNA的A260/A280值范圍為 1.67 ～2.02，平均值為 1.85;而氯仿異戊醇提取法提取 DNA的 A260/A280值相對較低，介于1.18 ～1.83之間，平均值為 1.46(圖2b).COI擴增產物凝膠電泳結果顯示，玻璃乳法提取休眠卵基因組DNA的PCR擴增產物濃度也明顯高于氯仿異戊醇法(圖3).

圖2 2種方法提取盔型溞休眠卵基因組DNA濃度(a)和純度(b)比較(Ⅰ代表氯仿異戊醇提取法;Ⅱ代表玻璃乳提取法)Fig.2 Comparison of DNA concentrations(a)and DNA purities(b)of resting eggs by Daphnia galeata using two methods(Ⅰ.Chloroform isoamyl alcohol method;Ⅱ.Ultra－Sep Beads method)

圖3 2種方法提取盔型溞休眠卵基因組DNA的COI基因PCR擴增電泳圖(Ⅰ代表氯仿異戊醇提取法;Ⅱ代表玻璃乳提取法)Fig.3 PCR products of DNA extractions of resting eggs by Daphnia galeata using two methods(Ⅰ.Chloroform isoamyl alcohol method;Ⅱ.Ultra－Sep Beads method)

3 討論

溞屬作為淡水生態(tài)系統(tǒng)的關鍵種類，其保存在沉積物中休眠卵的DNA信息常被用來研究生態(tài)環(huán)境變化與遺傳結構變化的關系［9－14］.因此，獲得高質量的DNA是此類研究的基礎.通過對比可以看出，2種方法都可用于溞屬休眠卵基因組DNA的提取(氯仿異戊醇提取法的成功率為27.5%，玻璃乳提取法的成功率為65.0%)，但是從DNA的提取成功率上看，玻璃乳提取法更適合休眠卵基因組DNA的提取，特別是針對底層沉積物保存時間較長的休眠卵，玻璃乳提取法的成功率更高(55.0%)，而氯仿異戊醇提取法對底層沉積物中休眠卵DNA提取的成功率僅為15.0%.核酸分析儀檢測結果顯示，玻璃乳提取法提取的DNA濃度也較氯仿異戊醇法高，對于表層沉積物中的休眠卵，玻璃乳提取法所獲得的DNA平均濃度為氯仿異戊醇法的2倍，然而對于在沉積物中保存時間相對較長的底層沉積物休眠卵，玻璃乳提取法所獲得的DNA平均濃度卻接近氯仿異戊醇法的3倍(圖2a).從2種方法的提取過程上來看，氯仿異戊醇法提取步驟繁瑣，所用試劑較多，特別是需要氯仿等有毒試劑，增加了對實驗操作人員危害的可能.而玻璃乳提取法所用試劑少，步驟簡單，整個提取過程所用時間短，吸附在玻璃乳上的DNA可以通過試劑盒中所含的Elution buffer快速洗脫下來，保證DNA的完整性和純度，可見，玻璃乳提取法提取枝角類休眠卵基因組DNA是一種切實可行的方法.

盡管2種方法都能提取底層沉積物休眠卵的DNA，但提取成功率明顯低于表層沉積物休眠卵的DNA提取成功率(氯仿異戊醇法對底層沉積物休眠卵的DNA提取成功率為15.0%，表層沉積物為40.0%;玻璃乳提取法對底層沉積物休眠卵的DNA提取成功率為55.0%，表層沉積物為75.0%)，這一差異與休眠卵在沉積物中保存的狀態(tài)和時間有關.位于沉積物表層2～10 cm中的休眠卵相對于沉積物底層休眠卵，形成時間較晚，容易獲得環(huán)境條件的直接誘導孵化進入現(xiàn)生種群［4，20，25］.因此具有較高的活性，更易從中獲得質量較高的DNA.而分布于沉積物底層中的休眠卵為水庫新建初期產生的，保存時間較長，含有完整休眠卵的卵鞍數(shù)較少，休眠卵萌發(fā)活性較低，DNA提取的質量和成功率相對較低，勢必會對下游PCR擴增反應產生影響［26］.因此，從底層沉積物中盡可能地分離保存較好的休眠卵將直接影響DNA提取的成功率以及后續(xù)研究.

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