于福來(lái)，黃梅，龐玉新*，王丹，謝小麗，陳振夏

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與 種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，海南 儋州 571737； 2.海南省艾納香工程技術(shù)研究中心 海南 儋州 571737)

栽培艾納香單株左旋龍腦和總黃酮含量變異分析△

于福來(lái)1，2，黃梅1，2，龐玉新1，2*，王丹1，2，謝小麗1，2，陳振夏1，2

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與 種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，海南 儋州 571737； 2.海南省艾納香工程技術(shù)研究中心 海南 儋州 571737)

目的：探討艾納香栽培群體內(nèi)主要化學(xué)成分個(gè)體變異規(guī)律，為艾納香優(yōu)良品種的定向選育奠定基礎(chǔ)。方法：選取同一栽培環(huán)境下相同株齡100個(gè)艾納香單株，采用GC測(cè)定左旋龍腦含量，紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定總黃酮含量。通過(guò)相關(guān)分析、標(biāo)準(zhǔn)差法分組比較等方法分析化學(xué)成分單株變異規(guī)律。結(jié)果：100個(gè)單株艾納香左旋龍腦變異系數(shù)為37.39%，總黃酮變異系數(shù)為20.13%；分組后左旋龍腦和總黃酮含量分別在3個(gè)組別間差異達(dá)到極顯著(P<0.001)水平；相關(guān)分析表明，兩類(lèi)成分間存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.084，n=100)，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：艾納香栽培群體內(nèi)單株化學(xué)成分含量變異較大，可為高含量育種提供材料。此外，艾納香葉片中左旋龍腦和總黃酮積累不具有協(xié)同性，應(yīng)分別對(duì)其進(jìn)行選擇。

艾納香；左旋龍腦；總黃酮；單株變異；定向選育

艾納香Blumeabalsamifera(L.)DC.為菊科多年生草本植物，在我國(guó)廣泛分布于海南、貴州、廣西、云南等省區(qū)[1]。艾納香新鮮葉片經(jīng)水蒸氣蒸餾、升華等一系列處理可制得中藥艾片(主要為左旋龍腦)，具開(kāi)竅醒神，清熱止痛之功效[2]。此外，艾納香中還含有黃酮等多種活性成分[3-4]。

艾納香人工種植歷史已有近百年，但長(zhǎng)期以來(lái)，艾納香藥材以野生為主，優(yōu)良品種缺乏的現(xiàn)狀仍未改變，規(guī)范化生產(chǎn)技術(shù)研究與推廣工作仍未落實(shí)到位，這直接導(dǎo)致艾納香藥材質(zhì)量不穩(wěn)定，難于有效控制。而通過(guò)人工定向選育良種是提高和穩(wěn)定艾納香藥材質(zhì)量的根本途徑。艾納香具有無(wú)性克隆繁殖特性[5]，通過(guò)系統(tǒng)選育優(yōu)良單株，建立優(yōu)良材料無(wú)性系是實(shí)現(xiàn)艾納香品種選育的重要途徑。植物化學(xué)成分為數(shù)量性狀，其合成積累受基因型和環(huán)境雙重因素影響。以往研究對(duì)不同產(chǎn)地、不同季節(jié)以及不同部位艾納香在揮發(fā)性成分和黃酮類(lèi)成分含量比較方面報(bào)道較多[6-8]，然而同一生長(zhǎng)環(huán)境不同單株間化學(xué)成分含量變異的研究未見(jiàn)報(bào)道。

基于此，本研究從艾納香化學(xué)成分定向選擇角度出發(fā)，通過(guò)測(cè)定同一栽培環(huán)境下相同株齡100株艾納香單株的左旋龍腦和總黃酮含量，進(jìn)而闡釋艾納香栽培群體內(nèi)化學(xué)成分在個(gè)體間變異規(guī)律，以期為高含量材料的選擇提供依據(jù)，為優(yōu)良艾納香品種的定向選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

2013年12月于海南儋州艾納香栽培基地隨機(jī)標(biāo)記100個(gè)同一年生單株(實(shí)生苗)，每株選取功能葉片20片，陰干后粉碎作為測(cè)試樣品。以上材料經(jīng)中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所龐玉新副研究員鑒定為艾納香Blumeabalsamifera(L.)DC.。

1.2 試驗(yàn)儀器

安捷倫7890A氣相色譜儀，氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)，安捷倫G4513A 16位自動(dòng)進(jìn)樣器，Sartarius CPA225D電子分析天平，KQ-500DB型超聲儀，UNICO2012-PCS紫外分光光度計(jì)，左旋龍腦對(duì)照品(阿法埃莎化學(xué)有限公司，純度>98%)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100080-200707，純度為92.5%)，水楊酸甲酯(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所，純度>99.5%)，乙酸乙酯，亞硝酸鈉NaNO2、硝酸鋁Al(NO3)3·9H2O、氫氧化鈉、乙醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 左旋龍腦含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 HP-5石英毛細(xì)管色譜柱(0.32 mm×30 m，0.25 μm)；以80 ℃為起始溫度，保持2 min，然后以5 ℃/min升溫至100 ℃，再以20 ℃/min升溫至200 ℃；進(jìn)樣口溫度為220 ℃；FID檢測(cè)器溫度為240 ℃；進(jìn)樣量0.6 μL，分流比為9∶1。左旋龍腦對(duì)照品和艾納香供試品色譜圖見(jiàn)圖1。

2.1.2 供試品的制備 精密稱(chēng)定艾納香葉片粉末(過(guò)20目篩)約2 g，置于50 mL具塞三角瓶中，加入乙酸乙酯25 mL，稱(chēng)定重量，在40 kHz的超聲條件下提取30 min，放冷，用乙酸乙酯補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取1 mL續(xù)濾液至10 mL容量瓶中，加入1 mL內(nèi)標(biāo)液(見(jiàn)2.1.3項(xiàng)下)，用乙酸乙酯定容，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液即得。

2.1.3 線(xiàn)性關(guān)系的考察 精密稱(chēng)定左旋龍腦對(duì)照品約100 mg，加乙酸乙酯定容至100 mL作為對(duì)照液。精密稱(chēng)定水楊酸甲酯約250 mg，加乙酸乙酯定容至250 mL作為內(nèi)標(biāo)液。量取對(duì)照液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL置于10 mL容量瓶中，同時(shí)加入內(nèi)標(biāo)溶液1.0 mL，以乙酸乙酯定容至刻度，即得混合對(duì)照品溶液。按照2.1.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定。以對(duì)照品中左旋龍腦質(zhì)量濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)(X)，對(duì)照品左旋龍腦與內(nèi)標(biāo)物水楊酸甲酯的峰面積比為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到線(xiàn)性回歸方程為：Y=14.823X+0.0129，r=0.999 9，結(jié)果表明，左旋龍腦在10.371～207.428 μg·mL-1與峰面積呈良好線(xiàn)性關(guān)系。

1.左旋龍腦 2.水楊酸甲酯圖1 左旋龍腦對(duì)照品(A)和供試品(B)色譜圖

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取某一艾納香藥材，按2.1.2項(xiàng)下操作制備供試品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果左旋龍腦與水楊酸甲酯的相對(duì)峰面積的RSD值為2.1%，表明精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一艾納香藥材5份，按2.1.2項(xiàng)下操作制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，結(jié)果測(cè)得左旋龍腦含量的RSD為3%，表明重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取艾納香藥材1份，按2.1.2項(xiàng)下操作制備供試品溶液，于室溫下放置，分別在0、2、4、8、12、24 h各進(jìn)樣一次，左旋龍腦與內(nèi)標(biāo)物的相對(duì)峰面積的RSD為0.49%，表明樣品在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)定6份已知含量的艾納香葉片粉末約1 g，每份樣品精密加入左旋龍腦標(biāo)準(zhǔn)品約5 mg，按2.1.2項(xiàng)下方法制備，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，結(jié)果得回收率在80%～120%之間，RSD為2.44%，表明回收率較高。

2.1.8 樣品含量測(cè)定 按照2.1.2項(xiàng)下操作制備樣品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，根據(jù)線(xiàn)性方程計(jì)算不同單株艾納香中左旋龍腦的含量。

2.2 總黃酮含量測(cè)定

2.2.1 顯色劑的配制 稱(chēng)取25 g NaNO2，用蒸餾水定容至500 mL，配成5%的NaNO2溶液，備用；稱(chēng)取88 g Al(NO3)3·9H2O，用蒸餾水定容至500 mL，配成10%的Al(NO3)3溶液，備用；稱(chēng)取20 g的NaOH，用蒸餾水定容至500 mL，配成4%的NaOH溶液，備用。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)定于105 ℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品約12 mg，置于50 mL容量瓶中，加75%乙醇溶液，置水浴鍋上微熱溶解，放冷，加75%乙醇至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)定艾納香藥材粉末(過(guò)20目)約0.5 g，至具塞錐形瓶中，加75%乙醇溶液25 mL，稱(chēng)定重量，在40 kHz下超聲提取40 min，放冷，稱(chēng)量，用75%的乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，即得供試品。

2.2.4 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 分別精密量取對(duì)照品溶液2.0 mL、供試品0.5 mL，將其分別置于25 mL容量瓶中，各加75%乙醇至10 mL，加5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置5 min，加10% Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻，放置5 min，加4% NaOH溶液10 mL，最后以75%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)的試劑溶液為空白，在300～999 nm波長(zhǎng)間進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，綜合分析選擇適宜測(cè)定波長(zhǎng)為509 nm。吸收曲線(xiàn)如圖2所示。

圖2 全波長(zhǎng)掃描圖

2.2.5 線(xiàn)性關(guān)系的考察 精密量取對(duì)照品溶液1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 mL分別置于25 mL容量瓶中，按2.2.4項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色反應(yīng)，以相應(yīng)的試劑溶液為空白對(duì)照，在509 nm處測(cè)定吸光度A。以對(duì)照品濃度C為橫坐標(biāo)(X)，吸光度A為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到線(xiàn)性回歸方程為Y=12.847X+0.009 3，r=1.000，結(jié)果表明，總黃酮在9.176～73.408 μg·mL-1與吸光度呈良好線(xiàn)性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取某一濃度的對(duì)照品溶液2 mL，置于25 mL的容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制項(xiàng)下操作，測(cè)定吸收值，連續(xù)6次，RSD值為1.05%，表明精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取某一濃度供試液，置于25 mL容量瓶中，按2.2.5項(xiàng)下操作，每隔10 min測(cè)定其吸光度，共計(jì)60 min，分析得出溶液在顯色后40 min內(nèi)RSD值為1.89%，表明在40 min內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品按2.2.3項(xiàng)下操作平行制備供試品溶液6份，按2.2.5項(xiàng)下操作，測(cè)定其吸光度，計(jì)算得平均濃度為13.91%，RSD值為3.8%。

2.2.9 加樣回收試驗(yàn) 精密稱(chēng)取6份已知濃度的艾納香藥材粉末(過(guò)20目篩)50 mg，分別加入相當(dāng)于供試品溶液總黃酮質(zhì)量的蘆丁對(duì)照品約7 mg，按2.2.3項(xiàng)下制備供試液，按2.2.5項(xiàng)下操作測(cè)定吸收值，結(jié)果得平均回收率為110%，RSD值為2.7%。

2.2.10 樣品含量測(cè)定 按照2.2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品溶液制備，按2.2.5項(xiàng)下操作測(cè)定供試品吸光度值，計(jì)算各不同單株艾納香中總黃酮的含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同單株艾納香葉片左旋龍腦和總黃酮含量基本統(tǒng)計(jì)量

依據(jù)100株艾納香葉片左旋龍腦和總黃酮含量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下(表1和圖3)，兩組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。其中，左旋龍腦最大值達(dá)10.71 mg·g-1，最小值僅1.50 mg·g-1，變異系數(shù)為37.39%。而總黃酮最大值206.59 mg·g-1，最小值為65.63 mg·g-1，變異系數(shù)為20.13%。說(shuō)明艾納香栽培群體內(nèi)單株間化學(xué)成分含量差異顯著。

表1 不同單株艾納香葉片左旋龍腦和總黃酮含量基本統(tǒng)計(jì)量 /mg·g-1

圖3 艾納香單株葉片左旋龍腦和總黃酮含量正態(tài)分布

3.2 不同組別艾納香單株左旋龍腦和總黃酮含量差異分析

采用標(biāo)準(zhǔn)差法進(jìn)行分組，均值加1倍標(biāo)準(zhǔn)差定為高、中組別臨界值，均值減1倍標(biāo)準(zhǔn)差定為中、低組別臨界值。據(jù)此將100個(gè)單株左旋龍腦和總黃酮含量數(shù)據(jù)劃分為高、中、低三組，同時(shí)對(duì)不同組別采用Duncan’s 法進(jìn)行多重比較，其結(jié)果列于表2。兩類(lèi)成分在三個(gè)組別間差異達(dá)到極顯著(P<0.001)水平。其中，左旋龍腦高含量組占14%，總黃酮高含量組占15%。結(jié)果提示，從現(xiàn)有栽培群體內(nèi)可實(shí)現(xiàn)優(yōu)良單株選擇。

表2 不同組別艾納香單株左旋龍腦和總黃酮含量差異分析

注：不同組別間多重比較采用Duncan’s法(P<0.001)

3.3 艾納香葉片左旋龍腦與總黃酮含量相關(guān)分析

為探討左旋龍腦與總黃酮在艾納香葉片中積累的協(xié)同性，進(jìn)一步通過(guò)Pearson相關(guān)分析(圖4)表明，兩者之間存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.084，n=100)，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果提示，同時(shí)選擇左旋龍腦和總黃酮高含量單株存在較大難度。

圖4 艾納香葉片左旋龍腦與總黃酮含量Pearson相關(guān)分析

4 結(jié)論與討論

4.1 艾納香栽培群體內(nèi)單株化學(xué)成分含量變異較大，可為高含量育種提供材料

艾納香是具有克隆生長(zhǎng)習(xí)性的多年生宿根性草本植物[5]，因此通過(guò)系統(tǒng)選育高含量單株，建立優(yōu)良材料無(wú)性系是實(shí)現(xiàn)艾納香品種選育的重要途徑。變異是選擇的基礎(chǔ)，對(duì)發(fā)生變異的生物體按照一定的方向和目標(biāo)連續(xù)選擇，就能使變異逐漸積累、鞏固和加強(qiáng)[9]。艾納香栽培群體內(nèi)左旋龍腦和總黃酮含量在單株間表現(xiàn)出較大差異，變異系數(shù)分別為37.39%和20.13%。同時(shí)左旋龍腦含量最大值(10.71 mg·g-1)和最小值(1.50 mg·g-1)相差達(dá)7.14倍；總黃酮含量最大值(206.59 mg·g-1)和最小值(65.63 mg·g-1)亦相差3.15倍。因此，當(dāng)以左旋龍腦或總黃酮為育種目標(biāo)時(shí)，從現(xiàn)有栽培群體內(nèi)篩選高含量單株具有較大的選擇潛力。

4.2 艾納香葉片中左旋龍腦和總黃酮積累不具有協(xié)同性，應(yīng)分別對(duì)其進(jìn)行選擇

本研究通過(guò)對(duì)100個(gè)樣本的左旋龍腦和總黃酮相關(guān)分析表明，兩類(lèi)成分不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)性(P>0.05)。提示兩類(lèi)成分在葉片中積累不具有協(xié)

同性。左旋龍腦為莰烷型雙環(huán)單萜類(lèi)化合物，是發(fā)生在質(zhì)體內(nèi)的脫氧木酮糖-5-磷酸途徑[10]。黃酮類(lèi)化合物的生物合成是通過(guò)苯丙烷代謝途徑完成[11]。同時(shí)，植物次生代謝產(chǎn)物合成存在組織分布特異性和積累時(shí)期特異性。所以，以左旋龍腦或總黃酮為育種目標(biāo)時(shí)，對(duì)優(yōu)良材料進(jìn)行選擇時(shí)應(yīng)將兩類(lèi)成分分開(kāi)選擇。

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IndividualVariationofl-borneolandTotalflavonoidsContentinBlumeabalsamifera(Ai-na-xiang)CulturedPopulation

YUFulai1，2，HUANGMei1，2，PANGYuxin1，2*，WANGDan1，2，XIEXiaoli1，2，CHENZhenxia1，2

(1.TropicalcropsGeneticResourcesInstitute，ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofCropGeneResourcesandGermplasmEnhancementinSouthernChina，Danzhou571737，China； 2.HainanProvincialEngineeringResearchCenterforBlumeaBalsamifera，Danzhou571737，China)

Objective：This study aimed at analyzing the individual variation ofl-borneol and total flavonoids content inBlumeabalsamifera(Ai-na-xiang)cultured population，which provides a theoretical basis for theB.balsamiferadirectional selection breeding with high-content bioactive components.Methods：The content ofl-borneol and total flavonoids randomly chosen from 100 one-year-old plants growing in the same field was determined by GC and UV respectively.Simple correlation analysis and standard deviation grouping were used to analyze the individual variation ofl-borneol and total flavonoids content.Results：The coefficients of variation(CV)ofl-borneol and total flavonoids content were 37.39% and 20.13% respectively.There were highly significant differences(P<0.001)ofl-borneol and total flavonoids content among three groups after standard deviation method grouping.Simple correlation showed thatl-borneol had positive correlation(r=0.084，n=100)with total flavonoids but not significant(P>0.05).Conclusion：Great individual variation ofl-borneol and total flavonoids content inB.balsamiferacultured population is beneficial for bioactive components directional selection breeding.There were different selective effects onl-borneol and total flavonoids for the accumulation ofl-borneol is inconsistent with that of total flavonoids inB.balsamifera.

Blumeabalsamifera；l-borneol；Total flavones；Individual variation；Directional selection

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.08.010

2014-03-23)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81303171，81374065)；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)(1630032013006)

*

龐玉新，副研究員，研究方向：南藥資源開(kāi)發(fā)與利用；Tel：(0898)23300268，E-mail：pyxmarx@126.com