潘遐，陶蘭萍，劉漢斌

(1.定西市藥品檢驗(yàn)檢測中心，甘肅 定西 743000； 2.定西市第一人民醫(yī)院，甘肅 定西 743000)

復(fù)方當(dāng)歸姜汁搽劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

潘遐1*，陶蘭萍1，劉漢斌2

(1.定西市藥品檢驗(yàn)檢測中心，甘肅 定西 743000； 2.定西市第一人民醫(yī)院，甘肅 定西 743000)

目的：建立復(fù)方當(dāng)歸姜汁搽劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用TLC鑒別制劑中當(dāng)歸、制何首烏；采用HPLC同時(shí)定量測定制劑中阿魏酸和二苯乙烯苷。結(jié)果：TLC能定性檢出當(dāng)歸、制何首烏，斑點(diǎn)清晰，且陰性對照無干擾；阿魏酸在0.131～0.789 μg與峰面積線性關(guān)系良好(r=0.999 9)，平均回收率為97.29%，RSD=0.85%；二苯乙烯苷在0.292～1.750 μg與峰面積線性關(guān)系良好(r=0.999 9)，平均回收率為98.48%，RSD=1.22%。結(jié)論：所建立的定性、定量檢測方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好，能有效地控制復(fù)方當(dāng)歸姜汁搽劑的質(zhì)量。

復(fù)方當(dāng)歸姜汁搽劑；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜法；高效液相色譜法；阿魏酸；二苯乙烯苷

復(fù)方當(dāng)歸姜汁搽劑是由甘肅省定西市第一人民醫(yī)院“復(fù)方當(dāng)歸姜汁搽劑”課題組在民間驗(yàn)方組方基礎(chǔ)上，整理改進(jìn)驗(yàn)方劑型，采用當(dāng)歸、制何首烏等4味中藥經(jīng)提取、加工、精制研發(fā)而成。用于治療脂溢性脫發(fā)[1]，具有很好的推廣應(yīng)用前景。方中當(dāng)歸補(bǔ)血活血，制何首烏補(bǔ)益精血養(yǎng)須發(fā)，兩藥合用共為君藥[2]。當(dāng)歸中主要成分為有機(jī)酸、豐富的氨基酸等，其中阿魏酸是較早被分離出來的主要成分之一；何首烏中主要成分為二苯乙烯苷、蒽醌類和磷脂[3]。為了有效控制復(fù)方當(dāng)歸姜汁搽劑質(zhì)量，課題組研究采用薄層色譜法對方中當(dāng)歸、制何首烏進(jìn)行定性鑒別，并采用高效液相色譜法同時(shí)測定本制劑中阿魏酸和二苯乙烯苷的質(zhì)量濃度。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司，包括LC-20AT型泵、SIL-20A型自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-10ASvp型柱溫箱、SPD-20A型紫外檢測器、ELSD-LTⅡ型蒸發(fā)光散射檢測器、CBM-20A型控制器、DGU-20A5型脫氣機(jī))；U-3900H型紫外可見分光光度儀(日本日立公司)；AUW220D型電子分析天平(日本島津公司)。

1.2 試藥

當(dāng)歸對照藥材(批號(hào)：120927-200613)、何首烏對照藥材(批號(hào)：120934-201009)、阿魏酸對照品(批號(hào)：110773-201012)、二苯乙烯苷對照品(批號(hào)：110844-201109)、藁本內(nèi)酯對照品(批號(hào)：111737-201204)，均購自中國食品藥品檢定研究院；薄層用硅膠G板(青島海洋化工有限公司)。乙腈、甲醇為色譜純；其他所用試劑為分析純；水為屈臣氏蒸餾水。

復(fù)方當(dāng)歸姜汁搽劑(定西市第一人民醫(yī)院“復(fù)方當(dāng)歸姜汁搽劑”課題組自制，批號(hào)：20110922，20110924，20110926)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 當(dāng)歸的薄層色譜鑒別[2-5]取本品10 mL，置分液漏斗中，加水10 mL，加乙醚30 mL振搖提取，分取乙醚液，置水浴上，蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。取當(dāng)歸對照藥材0.5 g，加乙醇20 mL，超聲處理10 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL溶解，作為對照藥材溶液。另取阿魏酸對照品、藁本內(nèi)酯對照品，加甲醇分別制成1 mg·mL-1的溶液，作為對照品溶液。取不含當(dāng)歸的其他處方量飲片，按制備工藝制成缺當(dāng)歸的陰性制劑樣品，按供試品溶液制備方法制備，作為缺當(dāng)歸的陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述5種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶1∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，而陰性對照無此斑點(diǎn)。見圖1。

1～3.供試品 4.當(dāng)歸對照藥材 5.阿魏酸對照品 6.藁本內(nèi)酯對照品 7.缺當(dāng)歸的陰性對照品圖1 復(fù)方當(dāng)歸姜汁搽劑中當(dāng)歸TLC圖

2.1.2 何首烏薄層色譜鑒別[2-3]取本品10 mL，置水浴上，蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。取何首烏對照藥材，加乙醇10 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為對照藥材溶液。取不含制何首烏的其他處方量飲片，按制備工藝制成缺制何首烏的陰性制劑樣品，按供試品溶液制備方法制備，作為缺制何首烏的陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。 供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的黃色斑點(diǎn)，而陰性對照無此斑點(diǎn)。見圖2。

1～3.供試品 4.何首烏對照藥材 5.缺何首烏陰性對照品圖2 復(fù)方當(dāng)歸姜汁搽劑中何首烏TLC圖

2.2 定量測定[6-7]

2.2.1 色譜條件 phenomenexC18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：乙腈-0.085%磷酸溶液(15∶85)；檢測波長：316 nm；體積流量：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃。理論板數(shù)按阿魏酸峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000，按二苯乙烯苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對照品和二苯乙烯苷對照品適量，加70%甲醇制成阿魏酸和二苯乙烯苷質(zhì)量濃度分別為65.736 μg·mL-1，145.838 μg·mL-1的混合溶液，作為混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取本品溶液5 mL，置10 mL容量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，即得供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 按本品處方及制備工藝分別制備缺當(dāng)歸及缺制何首烏的陰性樣品，照2.2.3項(xiàng)供試品溶液制備方法處理，即得缺當(dāng)歸及缺制何首烏的陰性對照溶液。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按2.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行色譜分離，記錄色譜圖，結(jié)果表明，在上述色譜條件下，供試品溶液中其他成分與阿魏酸、二苯乙烯苷分離良好，陰性對照色譜圖中阿魏酸峰和二苯乙烯苷峰處未檢測到峰，對測定結(jié)果無干擾。見圖3。

A.阿魏酸和二苯乙烯苷混合對照品 B.供試品 C.缺當(dāng)歸的陰性對照品 D.缺何首烏的陰性對照品圖3 復(fù)方當(dāng)歸姜汁搽劑及對照品HPLC圖

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述混合對照品溶液2，4，6，8，10，12 μL，注入液相色譜儀，按2.2.1項(xiàng)色譜條件測定阿魏酸和二苯乙烯苷的峰面積值。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積分值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得阿魏酸回歸方程：Y=365 546X，r=0.999 9(n=6)；二苯乙烯苷回歸方程：Y=303 100X，r=0.999 9(n=6)。結(jié)果表明阿魏酸在0.131～0.789 μg、二苯乙烯苷在0.292～1.750 μg與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下對照品溶液，按照2.2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，重復(fù)進(jìn)樣6次，阿魏酸和二苯乙烯苷峰面積的RSD分別為0.105%和0.115%(n=6)，表明方法精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液(20110922)分別于0，1，2，3，5，12，24 h各進(jìn)樣10 μL，記錄每次進(jìn)樣的峰面積。結(jié)果阿魏酸和二苯乙烯苷的RSD分別為0.921%和0.779%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(20110922)，照2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照2.2.1項(xiàng)下條件測定，重復(fù)進(jìn)樣6次，測得阿魏酸和二苯乙烯苷的平均質(zhì)量濃度分別為0.060 mg·mL-1和0.141 mg·mL-1，RSD分別為0.874%和0.614%(n=6)，表明重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的同一批樣品(20110922)3 mL，置10 mL量瓶中，共6份，另精密加入2.2.2項(xiàng)下的混合對照品溶液(阿魏酸和二苯乙烯苷質(zhì)量濃度分別為65.736 μg·mL-1，145.838 μg·mL-1)3 mL，加70%甲醇定容至刻度。按2.2.1項(xiàng)下條件測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1、2。

2.2.11 樣品測定 取3批復(fù)方當(dāng)歸姜汁搽劑樣品，按2.2.3制備成樣品溶液，照2.2.1項(xiàng)下條件測定阿魏酸、二苯乙烯苷的質(zhì)量濃度，結(jié)果見表3。

表1 復(fù)方當(dāng)歸姜汁搽劑中阿魏酸加樣回收率測定

注：阿魏酸對照品加入量均為0.197 mg

表2 復(fù)方當(dāng)歸姜汁搽劑中二苯乙烯苷加樣回收率測定

注：二苯乙烯苷對照品加入量均為0.438 mg

表3 復(fù)方當(dāng)歸姜汁搽劑中阿魏酸、二苯乙烯苷的測定(n=3)

3 討論

3.1 展開劑選擇

參照《中國藥典》[2]與其他文獻(xiàn)[4]，使用正己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶1∶1∶0.1)展開劑進(jìn)行當(dāng)歸的薄層鑒別，結(jié)果在供試品色譜中，在與對照品和對照藥材色譜相應(yīng)的位置，均顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照均無干擾。

3.2 波長選擇

通過紫外掃描可知，阿魏酸在316 nm處有最大吸收，二苯乙烯苷在320 nm處有最大吸收。結(jié)合HPLC將混合對照品在不同波長進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)在316 nm波長處阿魏酸、二苯乙烯苷的理論塔板數(shù)最大，分別為21 596、18 574，且分離度最大為5.804。綜合考慮，故選擇316 nm作為檢測波長。

3.3 流動(dòng)相的選擇

參照《中國藥典》[2]，通過改變流動(dòng)相比例能達(dá)到同時(shí)分離兩種成分的目的，最后確定最佳配比乙腈-0.085%磷酸(15∶85)為流動(dòng)相。分離效果較好，色譜圖形對稱且尖銳，拖尾因子分別為1.026、1.033，重復(fù)性強(qiáng)。

3.4 方法評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)所建立的定性、定量檢測方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好，能有效地控制復(fù)方當(dāng)歸姜汁搽劑的質(zhì)量。

[1] 龍倡達(dá)，張桂林，李紹興，等.中藥歸烏合劑治療斑禿療效觀察[J].中華皮膚科雜志，2000，33(2)：130.

[2] 國家藥典委員會(huì).中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：124，164.

[3] 肖培根，新編中藥志[M].第一卷.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001：425，518.

[4] 華永麗，郭延生，楊洪申，等.酒當(dāng)歸飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中成藥，2010，32(10)：1724-1729.

[5] 胡杰，馮麗莉，崔福德.當(dāng)歸川芎中阿魏酸提取的研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2004，15(11)：732-733.

[6] 班翊，劉其禮，金悠，等.二苯乙烯苷的穩(wěn)定性研究[J].中草藥，2004，35(11)：1235-1237.

[7] 張純，楊少麟，袁海龍，等.高效液相色譜法測定何首烏中二苯乙烯甙的含量及其穩(wěn)定性考察[J].中國中藥雜志，1999，24(6)：357-359.

QualityStandadforDangguiGingerLiniment

PAN Xia1，*，TAO Lanping1，LIU Hanbin2

(1.TheTestingCenterforDrugofDingxiCity，Gansu743000，China； 2.TheFirstPeople’sHospitalofDingxiCity，Gansu743000，China)

Objective：To establish the quality standard for Danggui Ginger Liniment.Methods：Angelica sinensis radix and Polygoni multiflori preparata radix identified by TLC，the contents of ferulic acid and stilbene glycoside were determined by HPLC.Results：The relevant spots on TLC plates were clear without any interference by the blank reference；The content of ferulic acid showed a good linearity in the range of 0.131～0.789 μg(r=0.999 9).The average recovery rate was 97.29%，RSD was 0.85%，the content of stilbene glycoside showed a good linearity in the range of 0.292-1.750 μg (r=0.999 9).The average recovery rate was 98.48%，RSD was 1.22%.Conclusion：Established qualitative and quantitative methods were simple，accurate，reliable and reproducible，and can be effectively used as the quality standard of Danggui Ginger Liniment.

Danggui Ginger Liniment；Quality standard；TLC；HPLC；Ferulic acid；Stilbene

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.08.012

2014-01-14)

*

潘遐，主管藥師，研究方向：中成藥、中藥材檢測分析；E-mail：panxia0932@163.com

glycoside