王俐萱，牛立營，潘英妮，齊文，劉曉秋

(沈陽藥科大學 中藥學院，遼寧 沈陽 110016)

中藥工業(yè)

UPLC法測定蒲黃提取物中總黃酮醇苷的含量

王俐萱，牛立營，潘英妮，齊文，劉曉秋*

(沈陽藥科大學 中藥學院，遼寧 沈陽 110016)

目的：建立蒲黃提取物中總黃酮醇苷的UPLC含量測定方法。方法：蒲黃提取物經(jīng)25%鹽酸水解后，應用WATERS UPLC超高效液相色譜儀，BEH C18色譜柱，PDA檢測器進行測定。以甲醇-0.1%甲酸溶液為流動相，流速為0.6 mL·min-1，檢測波長為370 nm，柱溫為35 ℃。結果：槲皮素、山柰酚和異鼠李素濃度分別在1.00～12.0 μg·mL-1、1.10～13.2 μg·mL-1和3.00～36.0 μg·mL-1與峰面積呈良好的線性關系；平均加樣回收率分別為100.4%(RSD=1.8%)，98.9%(RSD=2.0%)和99.2%(RSD=2.1%)。蒲黃提取物中總黃酮醇苷按照槲皮素、山柰酚和異鼠李素含量加和折算成總黃酮醇苷含量。結論：建立的蒲黃提取物中總黃酮醇苷的UPLC含量測定方法操作簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好，樣品處理簡便易行，為蒲黃提取物的質(zhì)量控制提供了有效的手段。

UPLC；蒲黃提取物；總黃酮醇苷；含量測定

蒲黃為香蒲科植物水燭香蒲TyphaangustifoliaL.、東方香蒲TyphaoriemalisPresl或同屬植物的干燥花粉，具有止血，化瘀，通淋的功能，用于吐血，衄血，咯血，崩漏，外傷出血，經(jīng)閉痛經(jīng)，胸腹刺痛，跌撲腫痛，血淋澀痛。研究表明，蒲黃提取物能增加冠狀動脈血流量、降低心肌攝氧率和心肌耗氧量[1]，具有防治心肌缺血性心血管疾病、保護血管內(nèi)皮細胞、抗血小板聚集及防止血栓形成等作用[1-5]。實驗室前期研究表明蒲黃提取物由十幾種以槲皮素、山柰酚和異鼠李素為母核的黃酮醇苷組成，主要包括香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷和槲皮素-3-O-新橙皮苷等，具有良好的內(nèi)皮細胞保護作用。目前有采用HPLC測定蒲黃提取物中異鼠李素-3-O-新橙皮苷及香蒲新苷含量的報道[6]，這兩個成分均是以異鼠李素為苷元。也有文獻報道用HPLC測定蒲黃和蒲黃炭中異鼠李素、槲皮素、山柰酚的含量作為蒲黃總黃酮的含量[7-8]。本文建立UPLC對蒲黃提取物酸水解后槲皮素、山柰酚和異鼠李素苷元含量進行測定，經(jīng)折算得總黃酮醇苷含量，對蒲黃提取物中總黃酮醇苷含量進行定量分析，從而對蒲黃提取物進行質(zhì)量控制的同時也可用此法對其提取工藝進行評價。本研究建立的UPLC測定蒲黃提取物中總黃酮醇苷的含量，與HPLC法相比，大大縮短了樣品分析時間[9-11]，此方法操作簡便、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可以作為蒲黃提取物質(zhì)量控制的研究方法。

1 儀器與材料

WATERS ACQUITY 超高效液相色譜儀(美國Waters公司，配有H-Class系統(tǒng)、自動進樣器與EmpowerTM軟件)，ACQUITY UPLC BEH C18柱(USA Waters公司)，F(xiàn)A120AC電子天平(上海越平科學儀器有限公司)。槲皮素、山柰酚、異鼠李素對照品(中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號分別為：100081-200907，110861-200808，110860-200608)，甲醇(色譜純，天津康科德科技有限公司)，乙腈(色譜純，美國Sigma-Aldrich公司)，娃哈哈飲用純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)，試劑均為分析純。

3批蒲黃藥材購于遼寧沈陽藥材市場，產(chǎn)地分別為遼寧、內(nèi)蒙古和河北，由遼寧省食品藥品檢驗所王維寧副主任藥師鑒定為正品，符合《中國藥典》2010年版要求。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm × 2.1 mm，1.7 μm)；流動相：甲醇-0.1%甲酸溶液(45∶55)；流速：0.6 mL·min-1；檢測波長：370 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：1 μL。

在上述色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液1 μL，注入液相色譜儀，測定。槲皮素、山柰酚和異鼠李素在3 min內(nèi)出峰，分離度良好，色譜峰理論塔板數(shù)均大于3 000，拖尾因子均在0.95～1.05，對照品和供試品色譜峰見圖1。

A.對照品 B.供試品1.槲皮素 2.山柰酚 3.異鼠李素圖1 蒲黃及對照品HPLC圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 蒲黃提取物制備 稱取不同批次蒲黃3份，每份100 g，加水10倍量，煎煮2次，每次1 h，冷卻過濾，合并濾液，將所得濾液吸附在AB-8大孔吸附樹脂上，分別用水、10%～90%乙醇梯度洗脫，收集總黃酮部位，減壓濃縮至干，得蒲黃提取物粉末。

2.2.2 供試品溶液制備[12]精密稱取蒲黃提取物粉末(2號樣品)約25 mg，精密稱定，加甲醇-25 %鹽酸溶液(4∶1)25 mL，置水浴中加熱回流30 min，迅速冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 對照品儲備液制備 精密稱取槲皮素對照品4.0 mg、山柰酚對照品4.4 mg和異鼠李素對照品12.0 mg，分別置于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別得質(zhì)量濃度為0.04，0.044，0.12 mg·mL-1的對照品儲備液。

2.3 線性關系考察

精密吸取對照品儲備液0.25，0.5，1.0，2.0，3.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得標準系列混合對照品溶液。在2.1項下色譜條件分析，以對照品峰面積(Y)為縱坐標，質(zhì)量濃度(X)為橫坐標，繪制標準曲線。槲皮素、山柰酚和異鼠李素回歸方程分別為Y=3 191.4X-1 081.1(r=0.999 7)，Y=3 787.3X-1 115.6(r=0.999 6)，Y=4 689X-4 961.1(r=0.999 6)。表明槲皮素、山柰酚和異鼠李素濃度分別在1.00～12.0，1.10～13.2，3.00～36.0 μg·mL-1線性關系良好。

2.4 精密度試驗

取槲皮素、山柰酚和異鼠李素質(zhì)量濃度分別為2.0，2.2，6.0 μg·mL-1的混合對照品溶液重復進樣6次，記錄色譜圖，按峰面積計算RSD，槲皮素、山柰酚和異鼠李素峰面積的RSD分別為1.7 %，1.7 %，1.4 %，結果表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

精密稱取樣品(2號樣品)，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，室溫下放置，并按2.1項下色譜條件于0，4，8，12，18，24 h進樣測定，結果表明供試品溶液室溫放置在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，槲皮素、山柰酚和異鼠李素峰面積的RSD分別為1.3%，1.7%，1.4%。

2.6 重現(xiàn)性試驗

精密稱取樣品(2號樣品)6份，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，并按2.1項下色譜條件進樣分析并記錄峰面積，計算槲皮素、山柰酚和異鼠李素的質(zhì)量分數(shù)分別為1.916%,2.534%,9.393%,其RSD分別為1.9%，2.1%，2.3%，結果表明方法重現(xiàn)性良好。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取2.2.1項下已知含量的蒲黃提取物粉末(2號樣品)6份，每份約12.5 mg，精密稱定，分別加入槲皮素、山柰酚和異鼠李素質(zhì)量濃度為0.040，0.044，0.12 mg·mL-1的對照品溶液適量。精密加入3種對照品溶液，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，依法測試，計算回收率，結果見表1。

2.8 總黃酮醇苷含量測定

取蒲黃提取物3批，按2.2.2項下制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件分析測定，分別計算蒲黃提取物中槲皮素、山柰酚和異鼠李素的含量，參照文獻蒲黃總黃酮醇苷與其水解后苷元換算系數(shù)為2.57，總黃酮醇苷質(zhì)量分數(shù)=(槲皮素量+山柰酚量+異鼠李素量)×2.57/供試品量[8-13]，結果蒲黃提取物中槲皮素、山柰酚和異鼠李素含量及總黃酮醇苷質(zhì)量分數(shù)見表2。

表1 蒲黃提取物中3種成分回收率試驗

表2 蒲黃提取物中總黃酮醇苷的測定 /%

3 討論

3.1 蒲黃提取物中黃酮類成分測定指標選擇的依據(jù)

以前的研究多采用HPLC測定異鼠李素-3-O-新橙皮苷及香蒲新苷的含量對其進行質(zhì)量控制，這兩種黃酮苷均以異鼠李素為母核，而蒲黃及其提取物中含多種黃酮，主要是以異鼠李素、槲皮素和山柰酚為母核的黃酮醇苷類化合物。因此，為了反映蒲黃黃酮中黃酮醇苷成分的含量，筆者建立了蒲黃提取物中總黃酮醇苷的UPLC含量測定方法，對蒲黃提取物中不易測定的黃酮苷類成分，通過酸水解法轉(zhuǎn)化為槲皮素、山柰酚和異鼠李素3種苷元形式進行含量測定，更準確地對蒲黃提取物進行質(zhì)量控制。

3.2 3種苷元選擇的依據(jù)

陶偉偉等[14]采用HPLC-PDA-MS技術對蒲黃中黃酮醇苷類成分進行鑒定，結果表明蒲黃黃酮中異鼠李素-3-O-新橙皮苷和香蒲新苷含量最多，此外還有槲皮素-3-O-(2G-α-L-鼠李糖基)-蕓香糖苷，槲皮素-3-O-新橙皮苷，山柰酚-3-O-(2G-α-L-吡喃鼠李糖基)-蕓香糖苷，山柰酚-3-O-新橙皮苷，異鼠李素-3-O-蕓香糖苷，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷等，其均是以槲皮素、山柰酚和異鼠李素為母核的黃酮醇苷類化合物。本方法選用蒲黃黃酮的主要苷元槲皮素、山柰酚和異鼠李素作為測定指標具有合理性。

3.3 樣品含量測定結果以及總黃酮醇苷計算說明

總黃酮醇苷的含量測定參照《中國藥典》銀杏葉提取物法，將蒲黃提取物中的黃酮醇苷類化合物經(jīng)水解后分別測出槲皮素、山柰酚及異鼠李素的含量，三者均為黃酮醇苷類化合物的苷元，故不以單個含量分別表示，而經(jīng)公式轉(zhuǎn)化為總黃酮醇苷含量計算。經(jīng)計算總黃酮醇苷含量(2號樣品)為35.32%，其中異鼠李素、槲皮素和山柰酚分別占67.76%，13.87%，18.36%。

3.4 流動相的選擇

分別對甲醇-水、甲醇-冰醋酸水溶液、甲醇-甲酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液作為流動相系統(tǒng)進行考察。結果表明，各色譜峰的對稱性在甲醇-0.1%甲酸水溶液中比甲醇-水流動相系統(tǒng)得到明顯改善，而甲醇-冰醋酸水溶液及乙腈-甲酸水溶液系統(tǒng)作為流動相對峰型及分離度影響不大，故選擇甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相系統(tǒng)。

本文所建立的蒲黃提取物中總黃酮醇苷的UPLC含量測定方法快速、準確，與傳統(tǒng)的HPLC含量測定方法相比，樣品運行時間大大縮短，峰形與分離度均較好，可使上述3個黃酮醇得到有效分離。本方法回收率好、精密度與穩(wěn)定性高、操作簡便，為蒲黃提取物中總黃酮醇苷的含量測定提供依據(jù)，為其質(zhì)量標準的制定奠定基礎。

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ContentDeterminationofTotalFavonolGlycosidedsofTyphaePollenExtractbyUPLC

WANG Lixuan，NIULiying，PANYingni，QIWen，LIUXiaoqiu*

(SchoolofTraditionalChineseMateriaMedica，ShenyangPharmaceuticalUniversity，Shenyang110016，China)

Objective：To establish a method for determination the total flavonol glycosides in Pollen Typhae extract by UPLC.Methods：Typhae Pollen extract which was acid hydrolysis by 25% hydrochloric.Chromatographic separation was carried out by the method of UPLC，the BEH C18column was used as chromatographic column，and methanol-0.1% formic acid water solution as mobile phase with a flow rate at 0.6 mL·min-1.The detection wavelength was 370 nm and column temperature was maintained at 35℃.Results：There was a good linear relationship which quercitrin，kaempferol and isorhanetin in the range of 1.00-12.0 μg·mL-1，1.10-13.2 μg·mL-1and 3.00-36.0 μg·mL-1，respectively.The average recoveries of quercitrin，kaempferol and isorhanetin were 100.4%(RSD=1.8%，n=6)，98.9%(RSD=2.0%，n=6)and 99.2%(RSD=2.1%，n=6)，respectively.The content of total flavonol glycosides in Pollen Typhae extract is based on amortized contents of quercitrin，kaempferol and isorhanetin.Conclusion：This method is simple in operation，high in sensitivity and good in reproducibility，and can be used for the determination of Pollen Typhae extract.

UPLC；Typhae Pollen extract；Total flavonol glycosides；Content

2014-04-21)

*

劉曉秋，博士，教授，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎及中藥質(zhì)量控制；Tel：(024)23986469，E-mail：liuxiaoqiu3388@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.09.011