董長萍，張丹，李生，劉傳貴，王兆華

(1.吉林華康藥業(yè)股份有限公司，吉林 敦化 133700；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長春 130012)

HPLC測定清胃止痛微丸中鹽酸小檗堿和芍藥苷的含量

董長萍1，張丹1，李生1，劉傳貴1，王兆華2*

(1.吉林華康藥業(yè)股份有限公司，吉林 敦化 133700；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長春 130012)

目的：采用高效液相色譜法在不同條件下測定清胃止痛微丸中鹽酸小檗堿和芍藥苷的含量。方法：鹽酸小檗堿檢測色譜柱為Diamonsil-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.033 mol·L-1磷酸二氫鉀(30∶70)，檢測波長為345 nm；芍藥苷檢測色譜柱為Shim-pack C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.3%磷酸水(12.7∶87.3)，檢測波長為230 nm。結(jié)果：鹽酸小檗堿進(jìn)樣量在0.016～0.080 μg與峰面積呈良好線性關(guān)系(r=0.999 8)，平均回收率為98.68%，RSD=0.74%；芍藥苷在進(jìn)樣量0.268～1.340 μg與峰面積呈良好線性關(guān)系(r=0.999 9)，平均回收率為99.03%，RSD=0.79%。結(jié)論：該方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏，重復(fù)性好，可用于清胃止痛微丸的質(zhì)量控制。

HPLC；鹽酸小檗堿；芍藥苷；清胃止痛微丸

清胃止痛微丸為中藥復(fù)方制劑，由黃連、白芍、地榆等5味中藥組成，具有清胃泄火，柔肝止痛的功能，用于胃脘痛(消化性潰瘍，慢性淺表性胃炎)、火郁證等?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為國家藥品標(biāo)準(zhǔn)(試行)WS-415(Z-047)-2001,采用薄層掃描法測定制劑中鹽酸小檗堿的含量，因測定誤差較大，方法繁瑣，不利于產(chǎn)品質(zhì)量控制，本文改用高效液相色譜法對鹽酸小檗堿進(jìn)行含量測定，同時(shí)對制劑中芍藥苷進(jìn)行測定，該測定方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高，能更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-10 AT高效液相色譜儀(日本島津公司)；SPD- 10A紫外檢測器(日本島津公司)；KQ-250型超聲波處理器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

1.2 試藥

鹽酸小檗堿對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110713-201212，含量：99.60%)；芍藥苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110736-201237，含量：99.65%)；清胃止痛微丸(吉林華康藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：131001，131002，131003)；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽酸小檗堿含量測定

2.1.1 色譜條件色譜柱為Diamonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.033 mol·L-1磷酸二氫鉀(30∶70)；流速為1 mL·min-1；檢測波長為345 nm；進(jìn)樣量為10 μL；理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

2.1.2 對照品溶液的制備 取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為40.6 μg·mL-1的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取清胃止痛微丸適量，研細(xì)，精密稱定0.1 g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇-鹽酸(100∶1)溶液50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定重量，加甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液即得。

2.1.4 陰性對照品溶液的制備 按處方量制備不含黃連的陰性樣品，按2.1.3方法制成缺黃連的陰性對照品溶液。

2.1.5 系統(tǒng)適應(yīng)性與陰性對照試驗(yàn) 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及缺黃連陰性對照品溶液各10 μL，按2.1.1色譜條件分析，供試品溶液色譜中，鹽酸小檗堿的保留時(shí)間為12.6 min，而陰性對照品溶液在此保留時(shí)間無干擾。見圖1。

A.鹽酸小檗堿對照品 B.樣品 C.缺黃連的陰性對照品 1.鹽酸小檗堿圖1 鹽酸小檗堿、清胃止痛微丸及陰性對照品HPLC圖

2.1.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液4，8，12，16，20 μL，注入高效液相色譜儀中進(jìn)行分析，以峰面積(Y)對鹽酸小檗堿進(jìn)樣量(X)進(jìn)行回歸，得鹽酸小檗堿回歸方程為Y=1 649 384.534X-2 068.077，r=0.999 8，表明鹽酸小檗堿在0.016～0.080 μg線性關(guān)系良好。

2.1.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液(批號(hào)：131001)，重復(fù)進(jìn)樣6次，按2.1.1色譜條件測定鹽酸小檗堿的峰面積，計(jì)算峰面積的RSD=0.32%，表明精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液(批號(hào)：131001)，分別于0，2，4，6，8 h進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算鹽酸小檗堿峰面積的RSD=0.39%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批清胃止痛微丸(批號(hào)：131001)6份，按2.1.3方法操作，制得供試品溶液，按2.1.1色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算鹽酸小檗堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.86 mg·g-1，RSD=1.53%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的清胃止痛微丸(批號(hào)：131001，鹽酸小檗堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.86 mg·g-1)研細(xì)粉末0.05 g，分別加入樣品實(shí)際含量80%、100%、120%的鹽酸小檗堿對照品，按2.1.1測定，結(jié)果見表1。

表1 清胃止痛微丸中鹽酸小檗堿加樣回收率試驗(yàn)

2.2 芍藥苷含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Shim-pack C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.3%磷酸水(12.7∶87.3)；流速為1 mL·min-1；檢測波長為230 nm；進(jìn)樣量為10 μL；理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.2.2 對照品溶液的配制 精密稱取在五氧化二磷干燥器中減壓干燥36 h的芍藥苷對照品適量，加甲醇制成67 μg·mL-1的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取清胃止痛微丸適量，研細(xì)，精密稱定0.4 g，置具塞錐形瓶中，加甲醇30 mL，稱定重量，超聲處理20 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對照品溶液的制備 按處方量制備不含白芍的陰性樣品，按2.2.3項(xiàng)下方法制成缺白芍的陰性對照品溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性與陰性對照試驗(yàn) 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及缺白芍陰性對照溶液各10 μL，按2.2.1色譜條件進(jìn)行色譜分析，供試品溶液色譜中，芍藥苷的保留時(shí)間為15.5 min，而白芍陰性對照溶液在此保留時(shí)間無干擾。見圖2。

A.芍藥苷對照品 B.樣品 C.缺白芍的陰性對照品 1.芍藥苷圖2 芍藥苷、清胃止痛微丸及陰性對照品HPLC圖

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取芍藥苷對照品溶液4，8，12，16，20 μL，注入高效液相色譜儀中進(jìn)行分析，以峰面積(Y)對芍藥苷進(jìn)樣量(X)進(jìn)行回歸，得芍藥苷回歸方程為Y=667 341.663X-19 706.319，r=0.999 9，表明芍藥苷在0.268～1.340 μg峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液(批號(hào)：131001)重復(fù)進(jìn)樣6次，按2.2.1色譜條件測定芍藥苷的峰面積，測得其峰面積的RSD=0.82%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液(批號(hào)：131001)，分別于0，2，4，6，8 h進(jìn)樣測定，記錄峰面積，測得芍藥苷峰面積的RSD=0.91%，供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)清胃止痛微丸(批號(hào)：131001)6份，按2.2.3方法操作，制得供試品溶液，按2.2.1色譜條件測定，芍藥苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.38 mg·g-1，RSD=1.17%，表明重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的清胃止痛微丸(批號(hào)：131001，芍藥苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)：4.38 mg·g-1)研細(xì)粉末0.2 g，分別加入樣品實(shí)際含量的80%、100%、120%芍藥苷對照品，按2.2.1方法測定，結(jié)果見表2。

表2 清胃止痛微丸中芍藥苷回收率試驗(yàn)

2.3 樣品測定

取3批清胃止痛微丸樣品，按2.1鹽酸小檗堿含量測定方法，分別精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定并計(jì)算鹽酸小檗堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，測定結(jié)果見表3。

表3 清胃止痛微丸中鹽酸小檗堿和芍藥苷的測定(n=3) mg·g-1

取3批樣品，按2.2芍藥苷含量測定方法，分別精密吸取芍藥苷對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定并計(jì)算芍藥苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，測定結(jié)果見表3。

3 討論

取鹽酸小檗堿對照品的甲醇溶液，于200～400 nm處進(jìn)行掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有3個(gè)吸收峰(230，265，345 nm)，確定鹽酸小檗堿檢測波長為345 nm。另取芍藥苷對照品溶液進(jìn)行掃描，確定芍藥苷檢測波長為230 nm。

鹽酸小檗堿的HPLC含量測定方法較多[1-4]，流動(dòng)相有乙腈-甲醇、水、冰醋酸等系統(tǒng)。筆者經(jīng)試驗(yàn)摸索，采用乙腈-磷酸二氫鉀系統(tǒng)為流動(dòng)相，色譜分離效果較為滿意，分離度及峰形對稱性較好。

芍藥苷的HPLC含量測定方法較多[5-6]，流動(dòng)相多采用乙腈-磷酸水系統(tǒng)。筆者經(jīng)試驗(yàn)摸索，采用乙腈-0.3%磷酸流動(dòng)相系統(tǒng)，分離效果較理想。

實(shí)驗(yàn)建立的清胃止痛微丸中鹽酸小檗堿和芍藥苷含量測定方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏，重復(fù)性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

[1] 黃新興，趙秀艷.HPLC測定消渴靈中鹽酸小檗堿含量測定[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2011，9(5)：186.

[2] 姜啟娟，孫仁爽，張棟.HPLC測定療癬卡西甫散中鹽酸小檗堿的含量[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2011，9(1)：215.

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DeterminationofBerberineHydrochlorideandPaeoniflorininQingweizhitongPelletbyHPLC

DONG Changping1，ZHANGDan1，LISheng1，LIUChuangui1，WANGZhaohua2*

(1.JilinHuakangStockLimitedCompanyofMedicines，Dunhua133700，China；2.AcademyofChineseMedicalSciencesofJilinProvince，Changchun130012，China)

Objective：To determine the content of berberine hydrochloride and paeoniflorin in Qingweizhitong pellet by high performance liquid chromatography in different conditions.Methods：The determination for berberine hydrochloride was conducted by Diamonsil-C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm).The mobile phase was acetonitrile-0.033 mol·L-1potassium phosphate monobasic(30∶70 for volume).The detection wavelength was 345 nm.The determination for paeoniflorin was conducted by Shim-pack C18(150 mm×4.6 mm，5 μm).The mobile phase was acetonitrile-0.3% phosphoric acid(12.7∶87.3 for volume).The detection wavelength was 230 nm.Results：Good linear relationship between area and amount was noted in the range of 0.016-0.080 μg for berberine hydrochloride with a correlation coefficient of 0.999 8.The average recovery of berberine hydrochloride was 98.68%，and the RSD was 0.74%.Good linear relationship between area and amount was noted for 0.268-1.340 μg for paeoniflorin with a correlation coefficient of 0.999 9.The average recovery of paeoniflorin was 99.03%，and the RSD was 0.79%.Conclusion：The established method is simple，accurate，sensitive and good repeatability，which can be applied for the quality control of Qingweizhitong pellet.

HPLC；Berberine hydrochloride；Paeoniflorin；Qingweizhitong pellet

2014-07-07)

*

王兆華，主任藥師，研究方向：中藥新藥與新制劑；Tel：(0431)86058659，E-mail：wangzhaohua221@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.12.015