李東明　韋媛　何升等

[摘 要] 目的：評價高效液相色譜分析在地中海貧血篩查與診斷中的價值。方法：采用高效液相色譜分析技術對32638例標本進行血紅蛋白分析，3678例標本進行了α-或β-地中海貧血基因檢測，ROC曲線分析HbA2和HbBarts的篩查截斷值。結果：32638例標本中檢出地中海貧血和血紅蛋病共4028例（12.34%）。經(jīng)基因確診β-地中海貧血重型8例、中間型34例和輕型2473例，以CD41-42、CD17、-28、IVS-Ⅱ-654、CD26、CD71-72和IVS-I-1及其復合最為常見，占98.73%。高效液相色譜技術篩查HbH病和HbCS的準確性為100%，以HbA2>3.8篩查輕型β-地中海貧血的靈敏度和特異性為96.84%和98.71%，以Hb Barts>58.1%篩查重型α-地中海貧血的靈敏度和特異性均為100%。結論：本地區(qū)地中海貧血發(fā)生率較高，高效液相色譜技術能有效篩出β-地中海貧血和重型α-地中海貧血，篩查HbH病和HbCS的準確性較好。

[關鍵詞] 高效液相色譜；地中海貧血；篩查

中圖分類號：R714.55 文獻標識碼：A 文章編號：2095-5200（2014）05-038-03

[Abstract] Objective： To evaluate the application of high performance liquid chromatographic （HPLC） in screen of thalassemia（thal）. Methods： Hemoglobin （Hb） electrophoresis was done by HPLC in 32638 cases，and DNA analysis of 3678 samples were further examined by PCR combined with Agarose electrophoresis and reverse dot blot. Results： Out of 32638 cases，There were 4028 cases detected as thal or abnormal Hb disease. By NDA analysis，8 were β-thal major，34 were β-thal intermedia，and 1594 were heterozygote of β-thal. The main gene types were CD41-42，CD17，-28，IVS-Ⅱ-654，CD26，CD71-72，IVS-I-1 and the Composite genotype of them，and which accounted for 98.71%. The accuracy of screening Hb H disease and Hb CS was 100%. To diagnose heterozygote of β-thal by HbA2 above 3.8%，the sensitivity and specificity were 96.84% and 98.73%. The optimal cutoff values of Hb Barts for screening of α-thal major were 58.1%，and the sensitivity and specificity were 100%. Conclusion： The population in Guangxi are at high risk of thal. HPLC is an effective screening method for β-thal and α-thal major，and it was exact to screen Hb H disease and Hb CS.

[Key words] High performance liquid chromatographic；thalassemia；screening

地中海貧血（簡稱地貧）是廣西最常見血液遺傳病，人群中α-、β-地貧和血紅蛋白病發(fā)生率較高分別為7.80%～17.51%，6.43%～7.53%，0.38%～0.52%[1-3]，這可能導致重型α-地貧（Hb Bart's癥）、中間型或重型β-地貧患兒的出生。Hb Bart's癥新生兒不能存活，且孕婦可能發(fā)生子癲、難產(chǎn)或產(chǎn)后出血等并發(fā)癥；而中間型、重型β-地貧患兒缺少有效的治療方法，絕大多數(shù)依靠輸血維持生命，這給家庭帶來沉重的負擔[4]。產(chǎn)前干預是預防該類患兒出生的有效方法，產(chǎn)前篩查是對高風險夫婦進行產(chǎn)前診斷的基礎，而出生后篩查可為地貧臨床診治提供依據(jù)。本研究采用高效液相色譜分析對本地區(qū)32638例就診人群進行地貧篩查，對篩查陽性者進行基因診斷，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 對象

2011年10月～2013年9月，在廣西壯族自治區(qū)婦產(chǎn)醫(yī)院、婦幼保健院門診就診及住院的患兒30270例，男13535例，年齡2月～6.9歲，女16735例，年齡2月～5.8歲。另有因地貧等進行產(chǎn)前診斷的孕婦2368例，年齡18～45歲，孕18～36周。

1.2 方法

1.2.1 血紅蛋白分析 抽取靜脈血2mL于枸櫞酸鈉抗凝管或在B超引導下經(jīng)腹行臍帶穿刺術取臍靜脈血2～3mL分別置于EDTA-K2和枸櫞酸鈉抗凝的2個試管。采用美國伯樂公司VARIANT高效液相色譜分析儀及配套試劑進行檢測，HbA2>3.5%或HbF>4.0%為β-地貧表型陽性，出現(xiàn)HbH、HbCS及HbBart's等為α地貧表型陽性，HbA2>10%疑為HbE病。

1.2.2 地貧基因分析 采用Gap-PCR擴增結合瓊脂糖凝膠電泳進行α-地貧缺失型：--SEA、-α3.7及-α4.2檢測，罕見α-地貧泰國缺失型：--Thai采用Gap-PCR結合瓊脂糖凝膠電泳檢測，引物由上海捷瑞公司合成，序列為F：CAC GAG TAA AAC ATC AAG TAC CCA CCC，R：TGG ATC TGC ACC TCT GGG TAG GTT CTG TAC C，擴增條件為：95℃預變性10min后進行35個循環(huán)擴增，每個循環(huán)包括98℃變性45s，62℃退火90s，72℃延伸3min，循環(huán)結束后72℃延伸5min；采用單管多重PCR結合反向點雜交技術檢測3種α-地貧突變型：αCSα、αWSα及αQSα和17種中國人常見β-地貧基因突變，試劑盒購于深圳亞能生物公司，按試劑盒說明書進行操作、質量控制及結果判斷。endprint

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用x±s表示，SPSS17.0軟件處理，ROC曲線確定HbA2、HbBart's截斷值。

2 結果

2.1 篩查情況

32638例標本中檢出異常血紅蛋白4028例，檢出率為12.34%。其中30270例外周血中檢出地貧和血紅蛋白病表型3412例，檢出率為11.27%，包括β-地貧2980例（9.85%）、α-地貧214例（0.70%）和血紅蛋白病218例（0.72%）。2368例臍血中檢出Hb Bart's 616例，檢出率為26.01%。

2.2 β-地貧基因診斷

2859例外周血進行了β-地貧基因檢測，檢出β-地貧2515例。其中β-地貧重型8例、中間型34例，其HbA2水平表現(xiàn)為降低、正?；蛏撸?地貧合并HbE時HbA2水平明顯增加，Hb F水平在不同年齡個體間差異較大，見表1。2515例中輕型β-地貧2473例，主要基因型依次為CD41-42（41.57%）、CD17（29.96%）、-28（7.36%）、IVS-Ⅱ-654（6.96%）、CD 26（5.54%）、CD 71-72（4.25%）和 IVS-I-1（3.07%），占98.71%，少見類型為-29、CD43、CD27-28、CD14-15和IVS-I-5，占1.29%；其表現(xiàn)為HbA2水平升高為主（3.1%～31.6%），伴或不伴HbF升高，以HbA2>3.8為臨界值篩查的靈敏度和特異性為96.84%和98.73%。

2.3 α-地貧基因診斷

3 討論

流行病學調查[1，4]顯示本地區(qū)β-地貧的發(fā)生率較高，中間型和重型患兒在貧血患兒中占的比例很高。本研究采用高效液相色技術對30270例人群外周血進行血紅蛋白分析，檢出β-地貧表型2980例，檢出率為9.85%。經(jīng)基因分析確診β-地貧2515例，基因型以CD41-42、CD17、-28、IVS-Ⅱ-654 、CD 26、CD71-72和 IVS-I-1最為常見，占98.71%，與余永雄等[5]報道的97.3%相近。其中檢出中間型和重型β-地貧42例，這表明在育齡人群中加強β-地貧產(chǎn)前篩查與診斷是非常必要的；其Hb特點為HbF明顯升高，含量為9.3%～98.6%，Hb A2含量可降低、正?；蛏?。有96.84%輕型β-地貧者（包括HbE?。┍憩F(xiàn)為HbA2升高，含量為3.1%～31.6%，結果顯示高效液相色技術可有效的篩出β-地貧和HbE病等。

α-珠蛋基因缺失或突變可導致珠蛋白肽鏈合成減少或合成HbCS等異常血紅蛋白，非α-鏈可形成HbBart's和HbH，通過Hb分析可有效地檢出該類血紅蛋白異常疾病。本研究對2368例臍血采用高效液相色技術進行Hb分析，其中603例經(jīng)基因分析確診α-地貧432例，其篩查靈敏度和特異性為90.66%和97.13%。以Hb Barts>58.1%篩查重型α-地貧具有較高的價值，其靈敏度和特異性均為100%；而篩查其他類型的α-地貧存在漏診或誤診，尤其是這些類型α-地貧的分類必須依靠基因分析。高效液相色技術篩查HbH病和HbCS的特異性為100%，而其檢出率卻明顯低于瓊脂糖或毛細管電泳[6]，且不能檢出Hb-WS H病，與Yin等[7]報道一致，這表明該方法對HbH病和HbCS的篩查存在較大的漏診。值得注意的是本研究中2例外周血中檢出HbH峰，而常規(guī)α-地貧基因檢測為-α3.7/-α3.7和αCS/αCSα，最后診斷為泰國缺失型HbH??；1例臍帶血HbBart's含量為32.6%，而基因分析為--sea/αα，不排除其他類型罕見HbH病。

綜上，本地區(qū)地貧的發(fā)生率較高，采用高效液相色技術能有效地檢出臍血中所有中間型、重型α-地貧和外周血中絕大多數(shù)β-地貧，而對其他類型的α-地貧存在漏診或誤診。因此，臨床應根據(jù)各項檢測結果結合臨床表現(xiàn)進行綜合分析。

參 考 文 獻

[1] Xiong F，Sun M，Zhang X，Cai R，et al. Molecular epidemiological survey of haemoglobinopathies in the Guangxi Zhuang Autonomous Region of southern China[J].Clin Genet，2010，78（2）： 139-148.

[2] 呂福通，謝丹尼，陳美佳，等. 地中海貧血干預的跟蹤隨訪工作探討[J].中國計劃生育學雜志，2009，17（5）：308-308.

[3] 李東明，玉晉武，韋媛，等.高效液相色譜分析在HbE篩查中的應用價值[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2013，10（7）：1808-1809，1811.

[4] Pan HF，Long GF，Li Q，et al. Current status of thalassemia in minority populations in Guangxi，China[J]. Clin Genet，2007，71（5）：419-426.

[5] 余永雄，黃麗，陳唯. 梧州地區(qū)β地中海貧血基因突變類型分析[J]現(xiàn)代預防醫(yī)學，2013，40（4）：740-741.

[6] Liao C，Zhou JY，Xie XM，et al. Screening for Hb Constant Spring in the Guangdong Province，SouthChina，using the Sebia capillary electrophoresis system[J]. Hemoglobin. 2011，35（1）：87-90.

[7] Xiao-Llin Yin，Xin-Hua Zhang，Tian-Hong Zhou，et al. Hemoglobin H Disease in Guangxi Province，Southern China： Clinical Review of 357 Patient[J].Acta Haematol，2010，124（2）：86-91.endprint

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用x±s表示，SPSS17.0軟件處理，ROC曲線確定HbA2、HbBart's截斷值。

2 結果

2.1 篩查情況

32638例標本中檢出異常血紅蛋白4028例，檢出率為12.34%。其中30270例外周血中檢出地貧和血紅蛋白病表型3412例，檢出率為11.27%，包括β-地貧2980例（9.85%）、α-地貧214例（0.70%）和血紅蛋白病218例（0.72%）。2368例臍血中檢出Hb Bart's 616例，檢出率為26.01%。

2.2 β-地貧基因診斷

2859例外周血進行了β-地貧基因檢測，檢出β-地貧2515例。其中β-地貧重型8例、中間型34例，其HbA2水平表現(xiàn)為降低、正?；蛏撸?地貧合并HbE時HbA2水平明顯增加，Hb F水平在不同年齡個體間差異較大，見表1。2515例中輕型β-地貧2473例，主要基因型依次為CD41-42（41.57%）、CD17（29.96%）、-28（7.36%）、IVS-Ⅱ-654（6.96%）、CD 26（5.54%）、CD 71-72（4.25%）和 IVS-I-1（3.07%），占98.71%，少見類型為-29、CD43、CD27-28、CD14-15和IVS-I-5，占1.29%；其表現(xiàn)為HbA2水平升高為主（3.1%～31.6%），伴或不伴HbF升高，以HbA2>3.8為臨界值篩查的靈敏度和特異性為96.84%和98.73%。

2.3 α-地貧基因診斷

3 討論

流行病學調查[1，4]顯示本地區(qū)β-地貧的發(fā)生率較高，中間型和重型患兒在貧血患兒中占的比例很高。本研究采用高效液相色技術對30270例人群外周血進行血紅蛋白分析，檢出β-地貧表型2980例，檢出率為9.85%。經(jīng)基因分析確診β-地貧2515例，基因型以CD41-42、CD17、-28、IVS-Ⅱ-654 、CD 26、CD71-72和 IVS-I-1最為常見，占98.71%，與余永雄等[5]報道的97.3%相近。其中檢出中間型和重型β-地貧42例，這表明在育齡人群中加強β-地貧產(chǎn)前篩查與診斷是非常必要的；其Hb特點為HbF明顯升高，含量為9.3%～98.6%，Hb A2含量可降低、正?；蛏?。有96.84%輕型β-地貧者（包括HbE?。┍憩F(xiàn)為HbA2升高，含量為3.1%～31.6%，結果顯示高效液相色技術可有效的篩出β-地貧和HbE病等。

α-珠蛋基因缺失或突變可導致珠蛋白肽鏈合成減少或合成HbCS等異常血紅蛋白，非α-鏈可形成HbBart's和HbH，通過Hb分析可有效地檢出該類血紅蛋白異常疾病。本研究對2368例臍血采用高效液相色技術進行Hb分析，其中603例經(jīng)基因分析確診α-地貧432例，其篩查靈敏度和特異性為90.66%和97.13%。以Hb Barts>58.1%篩查重型α-地貧具有較高的價值，其靈敏度和特異性均為100%；而篩查其他類型的α-地貧存在漏診或誤診，尤其是這些類型α-地貧的分類必須依靠基因分析。高效液相色技術篩查HbH病和HbCS的特異性為100%，而其檢出率卻明顯低于瓊脂糖或毛細管電泳[6]，且不能檢出Hb-WS H病，與Yin等[7]報道一致，這表明該方法對HbH病和HbCS的篩查存在較大的漏診。值得注意的是本研究中2例外周血中檢出HbH峰，而常規(guī)α-地貧基因檢測為-α3.7/-α3.7和αCS/αCSα，最后診斷為泰國缺失型HbH??；1例臍帶血HbBart's含量為32.6%，而基因分析為--sea/αα，不排除其他類型罕見HbH病。

綜上，本地區(qū)地貧的發(fā)生率較高，采用高效液相色技術能有效地檢出臍血中所有中間型、重型α-地貧和外周血中絕大多數(shù)β-地貧，而對其他類型的α-地貧存在漏診或誤診。因此，臨床應根據(jù)各項檢測結果結合臨床表現(xiàn)進行綜合分析。

參 考 文 獻

[1] Xiong F，Sun M，Zhang X，Cai R，et al. Molecular epidemiological survey of haemoglobinopathies in the Guangxi Zhuang Autonomous Region of southern China[J].Clin Genet，2010，78（2）： 139-148.

[2] 呂福通，謝丹尼，陳美佳，等. 地中海貧血干預的跟蹤隨訪工作探討[J].中國計劃生育學雜志，2009，17（5）：308-308.

[3] 李東明，玉晉武，韋媛，等.高效液相色譜分析在HbE篩查中的應用價值[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2013，10（7）：1808-1809，1811.

[4] Pan HF，Long GF，Li Q，et al. Current status of thalassemia in minority populations in Guangxi，China[J]. Clin Genet，2007，71（5）：419-426.

[5] 余永雄，黃麗，陳唯. 梧州地區(qū)β地中海貧血基因突變類型分析[J]現(xiàn)代預防醫(yī)學，2013，40（4）：740-741.

[6] Liao C，Zhou JY，Xie XM，et al. Screening for Hb Constant Spring in the Guangdong Province，SouthChina，using the Sebia capillary electrophoresis system[J]. Hemoglobin. 2011，35（1）：87-90.

[7] Xiao-Llin Yin，Xin-Hua Zhang，Tian-Hong Zhou，et al. Hemoglobin H Disease in Guangxi Province，Southern China： Clinical Review of 357 Patient[J].Acta Haematol，2010，124（2）：86-91.endprint

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用x±s表示，SPSS17.0軟件處理，ROC曲線確定HbA2、HbBart's截斷值。

2 結果

2.1 篩查情況

32638例標本中檢出異常血紅蛋白4028例，檢出率為12.34%。其中30270例外周血中檢出地貧和血紅蛋白病表型3412例，檢出率為11.27%，包括β-地貧2980例（9.85%）、α-地貧214例（0.70%）和血紅蛋白病218例（0.72%）。2368例臍血中檢出Hb Bart's 616例，檢出率為26.01%。

2.2 β-地貧基因診斷

2859例外周血進行了β-地貧基因檢測，檢出β-地貧2515例。其中β-地貧重型8例、中間型34例，其HbA2水平表現(xiàn)為降低、正?；蛏?，但β-地貧合并HbE時HbA2水平明顯增加，Hb F水平在不同年齡個體間差異較大，見表1。2515例中輕型β-地貧2473例，主要基因型依次為CD41-42（41.57%）、CD17（29.96%）、-28（7.36%）、IVS-Ⅱ-654（6.96%）、CD 26（5.54%）、CD 71-72（4.25%）和 IVS-I-1（3.07%），占98.71%，少見類型為-29、CD43、CD27-28、CD14-15和IVS-I-5，占1.29%；其表現(xiàn)為HbA2水平升高為主（3.1%～31.6%），伴或不伴HbF升高，以HbA2>3.8為臨界值篩查的靈敏度和特異性為96.84%和98.73%。

2.3 α-地貧基因診斷

3 討論

流行病學調查[1，4]顯示本地區(qū)β-地貧的發(fā)生率較高，中間型和重型患兒在貧血患兒中占的比例很高。本研究采用高效液相色技術對30270例人群外周血進行血紅蛋白分析，檢出β-地貧表型2980例，檢出率為9.85%。經(jīng)基因分析確診β-地貧2515例，基因型以CD41-42、CD17、-28、IVS-Ⅱ-654 、CD 26、CD71-72和 IVS-I-1最為常見，占98.71%，與余永雄等[5]報道的97.3%相近。其中檢出中間型和重型β-地貧42例，這表明在育齡人群中加強β-地貧產(chǎn)前篩查與診斷是非常必要的；其Hb特點為HbF明顯升高，含量為9.3%～98.6%，Hb A2含量可降低、正?；蛏摺Ｓ?6.84%輕型β-地貧者（包括HbE?。┍憩F(xiàn)為HbA2升高，含量為3.1%～31.6%，結果顯示高效液相色技術可有效的篩出β-地貧和HbE病等。

α-珠蛋基因缺失或突變可導致珠蛋白肽鏈合成減少或合成HbCS等異常血紅蛋白，非α-鏈可形成HbBart's和HbH，通過Hb分析可有效地檢出該類血紅蛋白異常疾病。本研究對2368例臍血采用高效液相色技術進行Hb分析，其中603例經(jīng)基因分析確診α-地貧432例，其篩查靈敏度和特異性為90.66%和97.13%。以Hb Barts>58.1%篩查重型α-地貧具有較高的價值，其靈敏度和特異性均為100%；而篩查其他類型的α-地貧存在漏診或誤診，尤其是這些類型α-地貧的分類必須依靠基因分析。高效液相色技術篩查HbH病和HbCS的特異性為100%，而其檢出率卻明顯低于瓊脂糖或毛細管電泳[6]，且不能檢出Hb-WS H病，與Yin等[7]報道一致，這表明該方法對HbH病和HbCS的篩查存在較大的漏診。值得注意的是本研究中2例外周血中檢出HbH峰，而常規(guī)α-地貧基因檢測為-α3.7/-α3.7和αCS/αCSα，最后診斷為泰國缺失型HbH??；1例臍帶血HbBart's含量為32.6%，而基因分析為--sea/αα，不排除其他類型罕見HbH病。

綜上，本地區(qū)地貧的發(fā)生率較高，采用高效液相色技術能有效地檢出臍血中所有中間型、重型α-地貧和外周血中絕大多數(shù)β-地貧，而對其他類型的α-地貧存在漏診或誤診。因此，臨床應根據(jù)各項檢測結果結合臨床表現(xiàn)進行綜合分析。

參 考 文 獻

[1] Xiong F，Sun M，Zhang X，Cai R，et al. Molecular epidemiological survey of haemoglobinopathies in the Guangxi Zhuang Autonomous Region of southern China[J].Clin Genet，2010，78（2）： 139-148.

[2] 呂福通，謝丹尼，陳美佳，等. 地中海貧血干預的跟蹤隨訪工作探討[J].中國計劃生育學雜志，2009，17（5）：308-308.

[3] 李東明，玉晉武，韋媛，等.高效液相色譜分析在HbE篩查中的應用價值[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2013，10（7）：1808-1809，1811.

[4] Pan HF，Long GF，Li Q，et al. Current status of thalassemia in minority populations in Guangxi，China[J]. Clin Genet，2007，71（5）：419-426.

[5] 余永雄，黃麗，陳唯. 梧州地區(qū)β地中海貧血基因突變類型分析[J]現(xiàn)代預防醫(yī)學，2013，40（4）：740-741.

[6] Liao C，Zhou JY，Xie XM，et al. Screening for Hb Constant Spring in the Guangdong Province，SouthChina，using the Sebia capillary electrophoresis system[J]. Hemoglobin. 2011，35（1）：87-90.

[7] Xiao-Llin Yin，Xin-Hua Zhang，Tian-Hong Zhou，et al. Hemoglobin H Disease in Guangxi Province，Southern China： Clinical Review of 357 Patient[J].Acta Haematol，2010，124（2）：86-91.endprint