高國賦，羅建軍，盧紅玲，鈕雅麗，魏寶陽

（1. 湖南省農(nóng)業(yè)信息與工程研究所，湖南 長沙410125；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學東方科技學院，湖南長沙410128；3. 湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術(shù)學院，湖南 長沙410128）

黑木耳[Auricularia auricula（L.ex Hook）underw.]屬于真菌門、擔子菌綱、異擔子菌亞綱、銀耳目、木耳科、木耳屬，其狀似耳朵，是一種可食用的大型真菌。黑木耳富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、粗纖維，還含有多種維生素和無機鹽、磷脂、植物固醇等[1-2]。黑木耳營養(yǎng)豐富，含鐵量很高，具有補血作用，還可以清潤腸胃、防止肥胖[3]。此外，黑木耳也是一種藥用食品，對冠心病、動脈硬化等心腦血管疾病有較好的防治作用，還能化解結(jié)石，預防直腸癌及其他消化系統(tǒng)癌癥[4-6]。

近年來，隨著栽培技術(shù)日趨成熟，黑木耳單產(chǎn)和產(chǎn)量均有大幅度增長。我國黑木耳無論是產(chǎn)量或質(zhì)量均居世界之首，產(chǎn)品在東南亞各國享有很高聲譽。黑木耳適宜生長在溫和濕潤，干濕相間的氣候生態(tài)環(huán)境。在同一地區(qū)同一品種人工栽培和天然生長的黑木耳營養(yǎng)成分有很大的區(qū)別[7]。目前國內(nèi)尚未見有關同一品種黑木耳在不同地區(qū)栽培的營養(yǎng)成分比較的報道。試驗對南北方黑木耳916 品種進行生物學特性和營養(yǎng)成分進行比較，旨在為南方引種黑木耳，發(fā)展黑木耳產(chǎn)業(yè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

湖南省溆浦縣盧峰鎮(zhèn)地坪村種植的黑木耳916 和吉林市蛟河市新站鎮(zhèn)老爺嶺村種植的黑木耳916。

取部分黑木耳在無菌水中浸泡數(shù)小時后放到80℃的恒溫干燥箱中干燥8 h，然后用粉碎機粉碎過80 目篩為待測樣品。

1.2 主要試劑

乙醚、牛血清蛋白、考馬斯亮藍G250、85%磷酸、95%乙醇、氯化鈉、磷酸緩沖液、優(yōu)級純硝酸、高氯酸、二次蒸餾水、稀鹽酸、乙醇、苯酚、標準葡萄糖、濃硫酸等均為國產(chǎn)分析純，購于上海強生制藥有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑木耳孢子和子實體切片的觀察 將南北方黑木耳樣品用水泡發(fā)，肉眼觀察外表特征。選平滑寬大的耳片用制作徒手切片，置于盛水的培養(yǎng)皿中吸水膨脹，20～30 min 后用解剖針挑去薄而均勻的切片按常規(guī)裝片，置顯微鏡下觀察。

將樣品耳片用無菌水侵泡2 h，在超凈工作臺上在用無菌水清洗4 次，用滅菌的吸水紙將表面水分吸干，懸掛于滅菌的三角瓶內(nèi)。24 h 后取出耳片，用無菌水將孢子稀釋按照常規(guī)裝片至顯微鏡下觀察[8]。

1.3.2 水分和粗灰分含量的測定 參考重量法測定黑木耳水分的含量。將處理好的樣品精確稱量5.00 g 放入預先干燥至恒重的玻璃皿中，放入95～105℃干燥箱中，干燥2～4 h 后，蓋好取出。置于干燥器中冷卻0.5 h 后稱量。再放入同溫度的烘箱中干燥1 h 左右，冷卻稱量，并重復干燥至恒重。根據(jù)公式（1）計算南方黑木耳中水分的質(zhì)量分數(shù)。

式（1）中：X 為樣品中水分的質(zhì)量分數(shù)（%）；m1為稱量皿和樣品的質(zhì)量（g）；m2為稱量皿和樣品干燥后的質(zhì)量（g）；m0為稱量皿的質(zhì)量（g）。

參考干灰化的方法對黑木耳測定粗灰分的含量[9]。精確稱取5.00 g 處理后的樣品于坩堝中，在電爐上加熱，使樣品灰化至無煙。將坩堝移至高溫爐中，550℃灼燒至無炭粒，冷卻到200℃時移入干燥器中，冷卻至室溫稱量。重復灼燒至前后2 次稱量相差不超過0.5 mg 為恒重。根據(jù)公式（2）計算南方黑木耳中灰分的質(zhì)量分數(shù)。

式（2）中：X 為樣品中灰分的質(zhì)量分數(shù)（%）；m1為坩堝和總灰分的質(zhì)量（g）；m2為坩堝和樣品的質(zhì)量（g）；m0為坩堝的質(zhì)量（g）。

1.3.3 粗脂肪含量的測定 參考索氏提取的方法并進行了改進，對黑木耳進行粗脂肪含量的測定比較[9-10]。將裝有5.00 g 樣品的濾紙筒放入索氏提取器的抽提筒內(nèi)，連接已干燥至恒重的脂肪燒瓶，提取冷凝管上端，加入95%乙醚至燒瓶內(nèi)容積的2/3 處，通入冷凝水。在水浴鍋中加熱，用脫脂棉塞入冷凝管上口。水浴溫度控制在使提取液每6～8 min 回流一次，提取8 h。取下脂肪燒杯，回收乙醚。待燒瓶內(nèi)乙醚僅剩下1～2 mL 時，在水浴鍋上趕盡殘留的溶劑，95～105℃下干燥2 h 后，移入干燥器中冷卻至室溫稱重。繼續(xù)干燥30 min 后冷卻稱重，反復干燥至恒重。根據(jù)公式（3）計算的南方黑木耳中粗脂肪的質(zhì)量分數(shù)。

式（3）中X 為樣品中粗脂肪的質(zhì)量分數(shù)（%）；m1為脂肪燒瓶和脂肪的質(zhì)量（g）；m 為樣品的質(zhì)量（g）；m0為脂肪燒瓶的質(zhì)量（g）

1.3.4 蛋白質(zhì)含量的測定 參考考馬斯亮藍的方法并進行改進，測定和比較黑木耳的蛋白質(zhì)含量[11-12]。

樣品溶液的制備：取1.00 g 經(jīng)液氮研磨的樣品加入5 mL 磷酸緩沖液，離心（4 000 r/min，10 min），將上清液倒入10 mL 容量瓶，再向殘渣中加入2 mL 磷酸緩沖液，懸浮后再離心，合并上清液，并定容至刻度待用。

標準蛋白質(zhì)溶液的配制：準確稱取牛血清蛋白100 mg，溶于0.5 mol/L 氯化鈉溶液中配制1 mg/mL 標準蛋白貯備液。

顯色劑：稱取考馬斯亮藍100 mg，溶于50 mL 95%乙醇中，再加入85%磷酸100 mL 用蒸餾水稀釋至1 000 mL。

標準曲線的制作：取6 只具塞試管，加入0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL 標準蛋白質(zhì)溶液，加蒸餾水至總體積為0.10 mL，再分別加入考馬斯亮藍G-250 試劑5.00 mL，蓋上塞子，搖勻，放置2 min 后在595 nm 波長下比色測定。另取2 支具塞試管，各加入南北方黑木耳各0.10 mL 樣品提取液，再加入0.90 mL 蒸餾水，5.00 mL 考馬斯亮藍G-250 試劑，充分混合，放置2 min 后，以標準曲線1 號試管做參比，在595 nm 波長下比色，記錄吸光度。

1.3.5 黑色素含量的測定 參考堿提酸沉的方法并進行了改進，測定了黑木耳黑色素含量[13]。稱樣品3.00 g，加入3 mol/L 鹽酸75 mL，在70℃恒溫水浴箱中浸提1 h，過濾，濾渣用氫氧化鈉堿化至pH 值為11，過濾，濾液用鹽酸酸化至pH 值為3，靜置，離心后，沉淀再用6 mL 1 mol/L 的氫氧化鈉溶解，等體積2 mol/L 鹽酸沉淀，反復此操作3 到5 次，沉淀用蒸餾水洗3 到5 次，離心，取固體常溫真空干燥，即得黑色固體粉末狀的黑木耳黑色素。按照以下公式計算黑木耳中黑色素的質(zhì)量分數(shù)。

式（4）中：X 為樣品中黑色素的質(zhì)量分數(shù)（%）；m1離心管和樣品的質(zhì)量（g）；m2為離心管和黑色素的質(zhì)量（g）；m0為離心管的質(zhì)量（g）。

1.3.6 微量元素含量的測定 參考龐海霞[14]的方法對黑木耳的微量元素進行了測定。

樣品前處理及容器凈化：將105℃烘干的黑木耳樣品磨碎至超微粉末狀過500 目篩，置于干燥稱樣瓶中，存放干燥器中備用；聚四氟乙烯坩堝放入稀鹽酸中，浸泡0.5 h 后用去離子水清洗凈化。

樣品制備：稱取0.10 g 黑木耳樣品，加入5 mL 硝酸，0.5 mL 高氯酸，蓋上坩堝蓋，放置過夜。第2 天將坩堝置于120℃可控恒溫電熱板上消化溶解。待試樣溶解完全，呈透明液時濃縮至體積約為1 mL，取下，冷卻后用蒸餾水定容到10 mL 容量瓶中，酸度控制在10%左右，搖勻待測。

用電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜儀測定微量元素的含量。

1.3.7 多糖含量的測定 參考苯酚硫酸法對黑木耳的多糖的含量進行測定[15-16]。

樣品溶液的制備：取樣品木耳1.00 g，用95%乙醇浸泡1 d 后，殘渣曬干，熱水浸提3 次，過濾，合并濾液，待冷后轉(zhuǎn)移于100 mL 容量瓶，加蒸餾水稀釋至刻度作供試品溶液。

試劑溶液的配制：6%苯酚溶液，于臨用前用80%苯酚溶液（取重蒸餾苯酚80 g 加蒸餾水20 g 溶解，搖勻置棕色瓶，4℃保存）加蒸餾水稀釋配制而成。

標準葡萄糖溶液的配制：精密量取105℃干燥至恒重的標準葡萄糖100 mg 置于100 mL 量瓶中，加蒸餾水配成1 mg/mL 的葡萄糖標準溶液。

標準曲線制備：分別精密吸取1 mg/mL 標準葡萄糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 置具塞的試管中，各以蒸餾水補至2.0 mL，依次加入6%苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，靜置10 min 后搖勻，室溫放置20 min，以2.0 mL 蒸餾水同法操作作為空白對照，在490 nm 波長處測定吸光度并記錄。

樣品中木耳多糖含量測定：吸取南北方黑木耳樣品溶液各1.0 mL 于具塞試管中，按上面的方法測定吸光度并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑木耳的顯微觀察

經(jīng)水泡發(fā)后肉眼觀察，南方黑木耳子實體中的膠質(zhì)略多于北方的；南方黑木耳表面呈褐色、朵狀，北方黑木耳表面呈深褐色、朵狀；北方的子實體比南方黑木耳的大1.5～1.9 cm。黑木耳孢子的顯微觀察結(jié)果如圖1 所示，在10×40 倍顯微鏡下，孢子呈無色，表面光滑，內(nèi)含豐富的孢質(zhì)，彎月形。南北方木耳孢子的形態(tài)結(jié)構(gòu)相似，沒有明顯差異。地域的差距對木耳孢子的形態(tài)特征無明顯影響。黑木耳在顯微鏡下觀察結(jié)果如圖2 所示，柔毛層透明有中線分割，常成彎曲狀，頂端圓基部褐色、膨脹，毛多叢生，少單生。髓部菌絲致密，分不清單條菌絲。菌絲之間結(jié)成網(wǎng)狀，致密或疏松，能清楚看到鎖狀聯(lián)合。菌絲分枝很發(fā)達，交織成致密的菌絲網(wǎng)。擔子與分叉菌絲緊密地交織在一起，不易分離。

圖1 南北方黑木耳孢子的觀察比較（10×40）

圖2 南北方黑木耳子實體切片的觀察比較

2.2 黑木耳的化學成分分析

2.2.1 蛋白質(zhì)標準曲線圖的繪制 以標準蛋白質(zhì)溶液的濃度為橫坐標，測得吸光度為縱坐標，繪制蛋白質(zhì)標準曲線圖（圖3）。根據(jù)樣品OD 值計算樣品中蛋白質(zhì)的濃度。

2.2.2 葡萄糖的標準曲線的繪制 以多糖濃度為橫坐標，光密度為縱坐標，繪制曲線（圖4），得回歸方程，由回歸方程計算供試液中葡萄糖的濃度含量。

圖3 蛋白質(zhì)標準曲線圖

圖4 葡萄糖標準曲線圖

2.2.3 黑木耳的營養(yǎng)成分 從表1 中可以看出，南方黑木耳的水分、粗脂肪、蛋白質(zhì)、多糖含量多于北方的；北方黑木耳的灰分、粗脂肪、黑色素、多于南方黑木耳灰分。

表1 不同產(chǎn)地黑木耳的營養(yǎng)成分

南方與北方黑木耳的礦質(zhì)元素含量見圖5，由圖5可知，南方黑木耳的鈉、鐵含量低于北方黑木耳，鎂含量高于北方黑木耳，其他礦質(zhì)元素含量差異不大。

圖5 南方黑木耳與北方黑木耳元素含量

3 結(jié) 論

試驗結(jié)果表明，南北方黑木耳均為朵狀，褐色，但南方黑木耳顏色稍淺，子實體小1.5～1.9 cm，子實體中的膠質(zhì)略多于北方的；南北方黑木耳的孢子形態(tài)結(jié)構(gòu)相似，均透明，呈月牙狀、腎形或柱形；在營養(yǎng)成分方面，南方黑木耳的水分、粗脂肪、蛋白含量顯著高于北方黑木耳，多糖略高于北方黑木耳，粗灰分及黑色素的含量低于北方黑木耳，鈉、鐵含量低于北方黑木耳，鎂含量高于北方黑木耳。由此可見同一品種的黑木耳在不同的地區(qū)栽培，其形態(tài)差異不大，但是化學成分有一定的差異，南北方各有優(yōu)劣。試驗中南方916 品種的黑木耳樣品的脂肪、蛋白質(zhì)和多糖的含量高于北方黑木耳的，因此在南方引種黑木耳品種916 不會降低黑木耳品質(zhì)，這有助于促進南方黑木耳栽培產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。當然，黑木耳各營養(yǎng)成分的含量也與栽培基質(zhì)有關，今后可進一步進行適用于南方的高產(chǎn)高品質(zhì)黑木耳栽培基質(zhì)的研究。

[1]張 鵬，姚方杰，王立軍，等.黑木耳形態(tài)發(fā)育研究的概述[J].中國食用菌，2010，（4）：185-187.

[2]高觀世，鄭躍玲.影響金耳多糖提取率因素的正交試驗[J].中國食用菌，2001，（4）：41-43.

[3]Wu J，Ding Z Y，Zhang K C.Improvement of exopoly saccharide production by macr of ungus Auricu laraauri cularin submerged culturel[J].Enzyme and Microbial Technology，2006，39（4）：743-749.

[4]宗燦華，于國萍.黑木耳多糖抑制腫瘤作用的研究[J].中國醫(yī)療前沿，2007，2，（12）：37-38.

[5]史亞麗，辛曉林，張昌言，等.黑木耳多糖對生物肌體運動能力的影響[J].基礎研究，2006，35（10）：107-108.

[6]王亞平，鄔春雨.黑木耳與紅霉素軟膏防止放射治療所致皮膚損傷的護理研究[J].中國當代醫(yī)藥，2010，17（5）：101-102.

[7]林 敏，吳冬青.天然黑木耳與栽培黑木耳的營養(yǎng)成分比較[J].食用菌，2003，12（4）：12-13.

[8]宋小亞，李 陽，劉德云.野生木耳擔孢子萌發(fā)特性研究[J].中國食用菌，2010，29（5）：12-13.

[9]馮 慧，洪家敏.索氏抽提法測定大豆粉中脂肪含量方法改進研究[J].中國食物與營養(yǎng)，2009，（8）：7-8.

[10]鐘紅艦，魏 紅，汪 紅.索氏抽提法測定粗脂肪含量的改進[J].監(jiān)督與選擇，2004，（1）：39-40.

[11]王孝平，邢樹禮.考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量的研究[J].天津化工，2009，23（3）：235-238.

[12]李 娟，張耀庭，曾 偉，等.應用考馬斯亮藍法測定總蛋白含量[J].中國生物制品學雜志，2000，2（13）：118-120.

[13]李 琦，侯麗華，劉 鑫，等.黑木耳黑色素鑒定及其提取工藝優(yōu)化[J].食品科學，2010，31（16）：87-92.

[14]龐海霞.秦巴山區(qū)黑木耳中微量元素的測定研究[J].營養(yǎng)與檢測，2011，4（28）：19-21.

[15]孔祥輝，張介馳，戴肖東，等.黑木耳多糖的提取與純化[J].生物技術(shù)，2005，1（15）：81-82.

[16]金麗梅，劉 偉，湯一哲，等.水提純沉淀法玉米須多糖提取工藝研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2007，5（19）：62-66.