朱貴忱 劉明雨 孫利鋒 才智 宋雪花

骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅中老年人健康的常見病，其發(fā)病率日益增加，其發(fā)病特征是骨量減少、骨強(qiáng)度減弱、骨密度降低等。西藥治療骨質(zhì)疏松因需長期服用，不良反應(yīng)大，療效亦不特別滿意。中藥在治療骨質(zhì)疏松癥時(shí)有其獨(dú)特的優(yōu)勢，因此近來成為研究骨質(zhì)疏松癥治療的熱點(diǎn)。其中，淫羊藿是中醫(yī)在治療骨質(zhì)疏松時(shí)的常用藥，有報(bào)道淫羊藿中的黃酮類成分淫羊藿苷能對去勢致骨質(zhì)疏松大鼠有防治作用［1］。本實(shí)驗(yàn)觀察淫羊藿苷對維甲酸致大鼠骨質(zhì)疏松的影響，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物:SD大鼠，清潔級(jí)，50只，雌性，280～300 g，購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(冀)2008-1-003。

1.1.2 試劑與儀器:淫羊藿苷，純度＞99%，購自南京崇原生物科技有限公司;維甲酸，購自重慶華邦制藥股份有限公司;鈣(Ca2+)、磷(P3+)、堿性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)試劑盒購自北京九強(qiáng)公司;羥脯氨酸(Hyp)試劑盒購自南京建成生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與給藥:SD大鼠，50只，隨機(jī)分為對照組、模型組、淫羊藿苷低劑量:50 mg/kg、淫羊藿苷中劑量組:100 mg/kg、淫羊藿苷高劑量組:200 mg/kg。每組10只動(dòng)物。采用維甲酸制備大鼠骨質(zhì)疏松模型:上午灌胃給予維A酸70 mg/kg，連續(xù)灌胃2周，對照組僅給予蒸餾水。2周后，按10 ml/kg灌胃給予淫羊藿苷，模型組給予等體積的蒸餾水，連續(xù)給藥4周。給藥結(jié)束后腹主動(dòng)脈取血處死動(dòng)物;取左側(cè)脛骨檢測骨生物力學(xué);右側(cè)脛骨檢測骨密度、Hyp;左側(cè)股骨進(jìn)行骨物理指標(biāo);右側(cè)股骨檢測骨生化。

1.2.2 血生化指標(biāo)檢測:取血，離心，生化分析儀測定血清Ca2+、P3+、堿性磷酸酶ALP、酸性磷酸酶ACP。

1.2.3 骨生化指標(biāo)檢測:取大鼠右側(cè)股骨，用電感偶合等離子體直讀光譜儀測定股骨中Ca2+、P3+的含量。取大鼠右側(cè)脛骨，按說明書步驟測定Hyp的含量。

1.2.4 骨物理學(xué)指標(biāo)檢測:大鼠右側(cè)脛骨，去除附著的肌肉和結(jié)締組織，應(yīng)用雙能X線骨密度儀測定骨密度。取大鼠左側(cè)股骨，剔除干凈，稱濕重;放置于烤箱80℃烘烤72 h至恒重，稱量股骨的重量，即得干重;取骨，用游標(biāo)卡尺測得股骨大轉(zhuǎn)子和股骨頸匯合處最低點(diǎn)到股骨髁間窩的距離為股骨長度;股骨曲面的第三轉(zhuǎn)子下行至股骨干交接之處，所得數(shù)值為股骨寬度。

1.2.5 骨生物力學(xué)檢測:取左側(cè)脛骨，三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)，測量最大彎曲力、抗彎強(qiáng)度、斷裂撓度、彈性段終點(diǎn)荷等生物力學(xué)參數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)，軟件計(jì)量資料以±s表示，進(jìn)行ANOVA分析處理和Dunnett檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血生化分析 模型組較正常組血清中Ca、P明顯下降(P ＜0.01)，ALP明顯上升(P ＜0.01)，與模型組比較，淫羊藿苷中、高劑組Ca、P顯著上升(P＜0.01)，低、中、高劑組ALP均顯著下降(P ＜0.01)，ACP在5組無明顯改變(P＞0.05)。見表1。

表1 淫羊藿苷對骨質(zhì)疏松大鼠血生化影響n=10，±s

表1 淫羊藿苷對骨質(zhì)疏松大鼠血生化影響n=10，±s

注:與正常組比較，*P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01

組別 Ca(mmol/L) P(mmol/L) ALP(U/L) ACP(U/L)2.39±0.29 2.18±0.22 70±12 4.0±0.7模型組 1.84±0.21* 1.54±0.18* 156±25* 4.4±0.7淫羊藿苷低劑組 1.89±0.19 1.60±0.16 99±14# 4.2±0.7淫羊藿苷中劑組 2.18±0.22# 1.99±0.28# 109±21# 4.2±0.7淫羊藿苷高劑組 2.33±0.27# 2.02±0.19# 89±14#正常組4.3±0.8

2.2 骨生化分析 模型組較正常組骨中Ca2+、P3+、Hyp明顯下降(P＜0.01)，與模型組比較，淫羊藿苷中、高劑組Ca2+顯著上升(P ＜0.05或＜0.01)，低、中、高劑組P3+、Hyp均顯著上升(P ＜0.01)。見表2。

表2 淫羊藿苷對骨質(zhì)疏松大鼠骨生化影響

2.3 骨物理指標(biāo)分析 模型組較正常組骨密度、濕重、干重明顯下降(P＜0.01)，與模型組比較，淫羊藿苷中、高劑組骨密度、濕重顯著上升(P＜0.05或＜0.01)，低、中、高劑組干重均顯著上升(P ＜0.01)，骨長、骨寬差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

2.4 骨生物力學(xué)指標(biāo)分析 模型組較正常組骨中最大彎曲力、抗彎強(qiáng)度、斷裂撓度、彈性段終點(diǎn)荷明顯下降(P ＜0.01)，與模型組比較，淫羊藿苷低、中、高劑組最大彎曲力、斷裂撓度顯著上升(P＜0.01)，中、高劑組抗彎強(qiáng)度顯著上升(P＜0.01)，高劑組彈性段終點(diǎn)荷顯著上升(P＜0.05)。見表4。

表3 淫羊藿苷對骨質(zhì)疏松大鼠骨物理指標(biāo)影響n=10，±s

表3 淫羊藿苷對骨質(zhì)疏松大鼠骨物理指標(biāo)影響n=10，±s

注:與正常組比較，*P ＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05，△P ＜0.01

組別 骨密度(g/cm2) 濕重(g) 干重(g) 骨長(mm) 骨寬(mm)正常組 0.36±0.04 1.09±0.18 0.66±0.09 33±4 3.02±0.39模型組 0.27±0.02* 0.84±0.17* 0.50±0.03* 33±4 2.95±0.29淫羊藿苷低劑組 0.28±0.03 0.98±0.15 0.57±0.06△ 33±4 3.01±0.32淫羊藿苷中劑組 0.33±0.05△ 1.05±0.21# 0.62±0.08△ 34±4 2.94±0.23淫羊藿苷高劑組 0.34±0.04△ 1.05±0.17# 0.63±0.09△33±3 3.01±0.46

表4 淫羊藿苷對骨質(zhì)疏松大鼠生物力學(xué)指標(biāo)影響

3 討論

選擇合適的動(dòng)物骨質(zhì)疏松模型是研究的關(guān)鍵［2］，目前建立骨質(zhì)疏松模型常用的動(dòng)物有大鼠、小鼠、犬、兔、綿羊，因大動(dòng)物費(fèi)用較高，研究者多數(shù)選擇大鼠建立骨質(zhì)疏松模型。復(fù)制大鼠骨質(zhì)疏松模型的方法又分為手術(shù)方法和化學(xué)方法，手術(shù)法有雙側(cè)卵巢切除法、去勢法，化學(xué)法有維甲酸法、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)法等。雙側(cè)卵巢切除法是切除雌性大鼠雙側(cè)卵巢，模擬臨床絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松的發(fā)生，此模型成功率高，但手術(shù)會(huì)引起大鼠創(chuàng)傷，且造模時(shí)間長。維甲酸是維生素A的衍生物，能夠激活破骨細(xì)胞的分化、增殖，促進(jìn)骨吸收，造成骨丟失，維甲酸致大鼠骨質(zhì)疏松模型造模時(shí)間短，穩(wěn)定，常被用于藥物的骨質(zhì)疏松研究［3］。選擇70 mg/kg維甲酸連續(xù)灌胃2周建立大鼠骨質(zhì)疏松模型，結(jié)果顯示模型組大鼠血清中 Ca2+、P3+下降，ALP上升，骨Ca2+、P3+丟失，骨密度、骨生物力學(xué)、物理學(xué)指標(biāo)等均下降，表明大鼠骨質(zhì)疏松模型建立成功。同時(shí)也表明維甲酸建立的骨質(zhì)疏松是以有機(jī)質(zhì)丟失為主，進(jìn)一步骨密度下降，骨韌性下降，骨脆性增高。

淫羊藿苷能防治維甲酸所致的骨質(zhì)疏松，表現(xiàn)在淫羊藿苷能提高血、骨中的Ca2+、P3+濃度和含量，降低ALP活性，升高骨中Hyp含量，ALP活性可反映出骨形成的程度，Hyp既能反映骨吸收，又能反映骨形成，表明淫羊藿苷能防止有機(jī)質(zhì)的丟失，抑制骨吸收，促進(jìn)骨形成;骨密度是檢測骨質(zhì)疏松的常用指標(biāo)［4，5］，我們觀察到淫羊藿苷能顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度，表明淫羊藿苷能夠提高骨密度;同時(shí)淫羊藿苷能提高骨濕重、干重，增加骨的最大彎曲力、抗彎強(qiáng)度、斷裂撓度、彈性段終點(diǎn)荷等生物力學(xué)參數(shù)，進(jìn)一步表明淫羊藿苷能增強(qiáng)骨強(qiáng)度，增大骨抵抗外力沖擊能力，降低骨脆性，減少骨折發(fā)生，進(jìn)而提示了淫羊藿苷對于維甲酸所致的骨質(zhì)疏松大鼠有一定的防治作用。

1 宋淵，李盛華，何志軍，等.淫羊藿苷對去勢雌性大鼠骨質(zhì)疏松的影響.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，33:400-403.

2 徐洪璋，余斌.骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型研究現(xiàn)狀.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，22:47-50.

3 許碧蓮，崔燎，陳文雙，等.維甲酸致大鼠骨質(zhì)疏松模型探討及丹參骨寶的預(yù)防作用.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26:539-543.

4 Terreni A，Pezzati P.Biochemical markers in the follow-up of the osteoporotic patients.Clin Cases Miner Bone Metab，2012，9:80-84.

5 Havrda JB.Pediatric bone densitometry.Radiol Technol，2012，84:155-177.