祁永清 李菊英 賀菊香 張夢嵐

高原缺氧的惡劣環(huán)境，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生一系列機(jī)能和形態(tài)的變化，胃腸道對缺氧較為敏感，可引起胃黏膜出血、胃潰瘍等消化系統(tǒng)疾病。在高原低氧地區(qū)胃黏膜出血、胃潰瘍、慢性萎縮性胃炎比平原地區(qū)高發(fā)。胃癌是高原地區(qū)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病趨于年輕化，而且大部分患者來就診時就已進(jìn)入了中晚期，失去了最佳的治療機(jī)會，是一種嚴(yán)重威脅高原地區(qū)人民生命健康的主要疾病。胃癌的發(fā)生是多因素參與的多階段、多步驟過程，導(dǎo)致細(xì)胞過度增生、異常分化、細(xì)胞凋亡減少而形成的。選擇特異性性抗體，對胃癌早期診斷及胃癌細(xì)胞生物學(xué)的影響和胃癌患者的預(yù)后評估有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2010年7月至2011年5月青海大學(xué)附屬醫(yī)院及青海省人民醫(yī)院送檢病理科的胃癌切除標(biāo)本60例，男38例，女22例;年齡35～80歲，平均55.7歲;高分化10例，中分化21例，低分化29例;淋巴轉(zhuǎn)移33例，無轉(zhuǎn)移27例。取正常體檢并本人自愿情況下的正常胃黏膜2～4塊，共10例。年齡28～74歲，平均年齡(47±8)歲。上述標(biāo)本，留取部分-80℃保存以備提取RNA，部分經(jīng)10%中性甲醛固定48 h，常規(guī)脫水、透明和包埋，連續(xù)切片，厚度為4μm，HE常規(guī)染色診斷，符合實(shí)驗要求的組織蠟片置于預(yù)先涂有多聚賴氨酸的載玻片烤干備用。

1.2 試劑 THBS4一抗為兔抗人多克隆抗體，購自美國GENETEX公司。即用型第二抗體A、B液、檸檬酸抗原修復(fù)液、PBS工作液、濃縮型DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。RT-PCR試劑:Trizol試劑(購自北京賽百盛公司)、RT-PCR試劑盒(購自美國Promega公司)、100bpDNA marker(購自上海生物工程公司)、PCR引物(購自上海生物工程公司)、瓊脂糖(購自上海GeneTech公司)、Tfis堿(購自美國Sigma公司)。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化S-P法檢測THBS4蛋白的表達(dá):石蠟切片(4μm)、37℃烤片過夜、二甲苯Ⅰ30 min，二甲苯Ⅱ脫蠟30 min、100%、95%、90%、85%、80%乙醇依次水化5 min、PBS洗3次×5 min、檸檬酸高壓抗原間接修復(fù)10 min、自來水中放置高壓鍋降溫，降至高壓鍋微溫時取出組織切片、滴加一抗(THBS4抗體稀釋度為1∶75、濕盒放置37℃溫箱2 h、PBS洗3次 ×5 min、滴加二抗(抗鼠/兔)，增強(qiáng)劑，濕盒放置37℃溫箱30 min、PBS洗3次×5 min、滴加二抗(抗鼠/兔)，穩(wěn)定劑，濕盒放置37℃溫箱30 min、鮮配制DAB顯色，鏡下控制5～10 min、PBS漂洗，終止顯色、蘇木素復(fù)染45 s，1%鹽酸酒精分色，溫水沖洗反藍(lán)、75%、95%、100%乙醇脫水各5 min，二甲苯透明，中性樹膠封片。組化染色中PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3.2 RT-PCR檢測THBS4mRNA在胃癌中的表達(dá):總RNA的提取:RIZOL試劑一步法總RNA提取，用紫外分光光度計測定總RNA的濃度。

1.3.3 cDNA的合成:用mRNA發(fā)轉(zhuǎn)錄成cDNA，各取5μg總 RNA，分別加入0.4μl oligodT，后加 DEPC-treated H2O至 20 μl，70℃，10 min變性，迅速插冰冷卻。各 加 入 5 × RT buffer 6 μl，dNTP 2 μl(2.5 mmol/L)，RNase抑制劑 0.5 μl(40 U/μl)，充分混勻。加入M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶各1μl，輕輕混勻，37℃孵育1 h，70℃ 15 min滅活，終止反應(yīng)。

1.3.4 設(shè)計引物，序列為:THBS4:202 bp

每次PCR反應(yīng)均設(shè)置no-template陰性對照，以1μl ddH2O代替模板，消除體系污染造成的假陽性。PCR反應(yīng)在Biometra熱循環(huán)儀中進(jìn)行。

1.4 反應(yīng)條件 94℃預(yù)變性4 min。循環(huán)參數(shù):94℃30 s;55℃ 45 s;72℃ 30 s。32 個循環(huán)后，72℃ 延伸10 min。

1.5 結(jié)果判定

1.5.1 免疫組化的結(jié)果判定:THBS4蛋白在細(xì)胞胞漿，及胞膜出現(xiàn)淡染的棕黃色顆粒;著色大于等于10%為陽性，小于10%為陰性。

1.5.2 THSB4的RT-PCR陽性表達(dá)結(jié)果判定:PCR產(chǎn)物行2.0%瓊脂糖凝膠(含0.25μg/ml EB)電泳。分別取樣品PCR產(chǎn)物6μl以80 V電壓電泳約30 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，照相記錄實(shí)驗結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，臨床病理指標(biāo)與表達(dá)程度之間采用χ2檢驗，當(dāng)n≥40但有1≤T＜5時，以及n＜40或T＜1時，四格表資料結(jié)果采用fisher確切概率法檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中THBS4 mRNA的表達(dá)情況 胃癌組織中THBS4 mRNA表達(dá)陽性者39例(65.0%)，表達(dá)陰性者21例(35.0%)，在不同分化胃癌組織中呈現(xiàn)差異表達(dá)(圖1)。

圖1 RT-PCR檢測不同分化胃癌組織THBS4的差異表達(dá)

2.2 胃癌組織中THBS4 mRNA的差異表達(dá)與不同臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系 在60例胃癌標(biāo)本中THBS4mRNA陽性表達(dá)39例，陽性表達(dá)率65.0%。男性表達(dá)23例，陽性率60.5%，女性中表達(dá)16例，陽性率72.7%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。在不同的年齡組THBS4mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。在高分化組中THBS4mRNA的陽性表達(dá)率為50.0%，中分化組陽性表達(dá)率為47.6%，低分化組陽性表達(dá)率為82.7%，在組內(nèi)進(jìn)行兩兩比較，高分化與中分化胃癌的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，與低分化的胃癌相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。中分化組與低分化組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組THBS4mRNA陽性表達(dá)率為78.8%，無轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率為48.1%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。THBS4mRNA陽性表達(dá)在臨床分期差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 胃癌組織中THBS4 mRNA在不同臨床病理指標(biāo)的表達(dá)

2.3 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果

2.3.1 THBS4蛋白的在胃癌組織中的表達(dá):在胃癌組織檢測THBS4蛋白的表達(dá):在正常胃黏膜細(xì)胞胞漿內(nèi)無棕色顆粒，在高分化胃癌組織中有癌細(xì)胞胞漿著色，染色較淡。在中分化的胃癌細(xì)胞中棕色顆粒染色加深，低分化胃癌細(xì)胞胞漿及胞核內(nèi)彌漫出現(xiàn)深染的棕色顆粒 (圖2)。

圖2 THBS4在不同胃黏膜組織中的表達(dá)

2.3.2 胃癌組織中THBS4蛋白陽性表達(dá)與病理指標(biāo)之間的關(guān)系:在60例胃癌組織中THBS4蛋白陽性34例，陽性表達(dá)率為56.7%，THBS4蛋白的陽性表達(dá)與胃癌患者的年齡及性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。THBS4蛋白在胃癌高分化組陽性表達(dá)率為40.0%，在中分化陽性表達(dá)38.1%，在低分化組陽性表達(dá)為75.8%，與低分組相比差異有顯著性(P＜0.05)。THBS4蛋白的陽性表達(dá)在淋巴轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。THBS4蛋白的陽性表達(dá)在臨床病理分期差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見表2。

表2 胃癌組織中THBS4蛋白陽性表達(dá)與病理指標(biāo)的關(guān)系

3 討論

THBS4基因是THBS家族新成員，它的結(jié)構(gòu)與這個家族其他成員基本相同，有一個球狀的氨基端和一個球狀的羧基端。N末端區(qū)域的氨基酸殘基與肝素結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞間接觸、游走、增殖及血小板聚集。C末端可與整合蛋白相關(guān)蛋白(IAP)結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞粘附、游走、血小板聚集。但在N端缺少原膠原同源重復(fù)序列和備解素重復(fù)序列，兩個半光氨酸殘基在原膠原同源區(qū)，THBS4的這種分子結(jié)構(gòu)決定了殘基的多肽性，而且THBS4的出現(xiàn)與該家族相比極大的限制了在其他組織中的表達(dá)，它高表達(dá)于正常心肌和骨骼?。?］。它在心臟的發(fā)育和骨骼肌的發(fā)育中起了重要作用。THBS4是細(xì)胞外基質(zhì)，它可以促進(jìn)細(xì)胞的增生與黏附，可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的成熟［2］。THBS4結(jié)構(gòu)中由于沒有原膠原同源區(qū)來抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增生;沒有備解素重復(fù)序列，不能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，這可能是THBS4基因促進(jìn)血管形成原因之一。THBS4在腫瘤中的研究較少，有學(xué)者在結(jié)直腸癌中研究發(fā)現(xiàn)，THBS4在結(jié)直腸癌中表達(dá)比正常腸黏膜還低，這種THBS4的表達(dá)缺失［3］，說明了THBS4可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的選擇性生長優(yōu)勢。在有些腫瘤中過表達(dá)，可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長的能力［4］。有學(xué)者研究THBS4基因與動脈粥樣的發(fā)生有關(guān)［5］。在本組實(shí)驗中THBS4蛋白在中低分化胃癌中表達(dá)比高分化胃癌高，在胞漿內(nèi)的著色也隨著胃癌分化程度的降低而加深，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在淋巴轉(zhuǎn)移組中THBS4蛋白表達(dá)比無淋巴轉(zhuǎn)移組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。THBS4-mRNA與蛋白在胃癌組織中表達(dá)說明 THBS4對細(xì)胞的增殖起了上調(diào)作用，促進(jìn)了細(xì)胞大量增生。發(fā)生的機(jī)制不清楚，可能與THBS4特定的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，THBS4基因使caspas3活性降低從而使本應(yīng)進(jìn)入凋亡程序的細(xì)胞沒有被識別，得以生存并增殖。有文獻(xiàn)報道THBS4正常情況下高表達(dá)在心肌和骨骼肌，在肺組織、胰腺、腦組織、結(jié)腸中僅有少量的表達(dá)，而在胎盤、肝臟、腎臟中無表達(dá)［6］。

綜上所述，THBS4基因是一種細(xì)胞外基質(zhì)的糖蛋白，在胃癌組織中呈陽性表達(dá)，與胃癌的分化程度有關(guān)，在中低分化的胃癌中高表達(dá)，與浸潤深度有關(guān)，隨浸潤的深度陽性表達(dá)越高，與淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，在淋巴轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)比無轉(zhuǎn)移組高。THBS4的陽性表達(dá)可以上調(diào)CTGF的表達(dá)，在高分化胃癌中CTGF的陽性表達(dá)低于低分化胃癌，差異有顯著性。THBS4通過P53蛋白的突變抑制了細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖與分化;促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞的增生，有利于血管的形成。隨著THBS4蛋白陽性表達(dá)增高血管密度也增加，差異有顯著性。THBS4基因具有多種功能，在腫瘤的形成中通過多種途徑發(fā)揮作用。THBS4基因在胃癌中可作為判斷與預(yù)后的指標(biāo)。

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