李景華，趙炎蔥，韓 光

（1.河南大學 天然藥物與免疫工程重點實驗室，河南 開封475001； 2.河南大學 第一附屬醫(yī)院，河南 開封475001；3.河南大學 藥學院，河南 開封475001）

L－肉毒堿（L－Carnitine）亦稱維生素BT，其化學式為C7H15O3N，相對分子質(zhì)量為162.2，是人類必需的營養(yǎng)物質(zhì)，具有抗心肌缺血，抗心率失常，促進脂類代謝，降低血脂，治療肥胖等作用［1－2］，由此成為研究的熱點.近些年，市場上出現(xiàn)了多種以L－肉毒堿為主要成分的降血脂藥物.L－肉毒堿的檢測方法主要有：高效液相色譜法［3－6］，酶技術(shù)測定法［7］，滴定法［8］等.滴定法較為粗放，很難測出L－肉毒堿的準確含量；酶技術(shù)測定法主要用于血液制品；液相色譜法具有操作簡便，準確度高等優(yōu)點，因此被廣泛用于L－肉毒堿的分析.已報道的液相色譜法中均采用C18柱［3－6］，本課題組也在本藥品測定中利用這些方法進行了預(yù)實驗，但出現(xiàn)保留時間短，分離度不好，峰形差等現(xiàn)象，其原因可能是L－肉毒堿的極性較大，極易溶于水.氨基柱兼具正相與反相柱的性質(zhì)，具有適當?shù)臉O性，對L－肉毒堿具有較適當?shù)谋Ａ魰r間，且峰形較好.本文采用HPLC法，利用氨基柱對降血脂藥物中的L－肉毒堿的含量進行了測定，結(jié)果表明，該測試方法操作簡單，準確度高，為有效控制該類含L－肉毒堿的降血脂藥物質(zhì)量提供了依據(jù).

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC 2010A高效液相色譜儀（日本島津公司，LC 2010四元體系混合泵，LC 2010紫外檢測器，CLASS VP色譜工作站），KQ 300CDE型數(shù)控超聲波發(fā)生器（昆山市超聲儀器有限公司）；AG135電子天平（梅特勒－托利多公司）.

L－肉毒堿標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號為1105072－201204，純度≥99.65%），降血脂藥物（市售，批號為20121025、20121106、20121115，主要由銀杏提取物、L－肉毒堿和紅曲粉及β－環(huán)糊精組成，制劑規(guī)格0.3g），乙腈為色譜純（天津四友化學試劑有限公司）；KH2PO4及NaOH均為分析純；水為二次蒸餾水.

1.2 色譜條件

色譜柱：Kromasil氨基柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈∶KH2PO4溶液（6.81g／L，NaOH調(diào)至pH＝4.7）＝65∶35；流速：1.0mL／min；柱溫：30℃.

測定波長的選擇：取L－肉毒堿標準品溶液適量，在190～800nm波長范圍內(nèi)進行掃描，發(fā)現(xiàn)205nm處有最大吸收，故選擇205nm作為檢測波長.

1.3 標準品溶液的配制

準確稱取4mgL－肉毒堿標準品置于10mL容量瓶中，加入流動相適量，超聲溶解，室溫冷卻；搖勻，用流動相定容至刻度；用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得.

1.4 樣品溶液的配制

取降血脂藥物適量，除去膠囊殼，取出內(nèi)容物，碾碎，混勻；精密稱取粉末30mg加入25mL容量瓶中，加入流動相適量，超聲溶解，冷卻；搖勻，用流動相定容至刻度；用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得樣品溶液.

2 結(jié)果與討論

2.1 標準曲線的建立

取L－肉毒堿標準品溶液，分別采用0.5、5、15、20和25mL進樣，記錄得色譜圖（圖1），對應(yīng)的峰面積分別為8 542、84 097、252 192、336 583、421 565.以進樣量為橫坐標，以峰面積為縱坐標作回歸曲線，得回歸方程y＝16 848.98x－125.89，（r＝0.999 9）（圖2）.結(jié)果表明，當L－肉毒堿的濃度為0.4g／L時，其注射體積在0.5～10mL范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系.

圖1 L－肉毒堿標樣的色譜圖Fig.1 Chromatograms of standard L－camitine conten

圖2 回歸曲線圖Fig.2 Regression curve

2.2 穩(wěn)定性實驗

取樣品溶液（批號為20121106），分別在0、1、2、4、8、12、24h后進樣，進樣量為10μL.記錄樣品的峰面積，計算得到L－肉毒堿的質(zhì)量分數(shù)（表1），并由此計算出質(zhì)量分數(shù)的RSD為0.80%，表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定.

表1 穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 1 Testing results of stability

2.3 精密度實驗

取L－肉毒堿標樣溶液（0.4g／L），連續(xù)進樣6次，進樣量均為10μL.測得樣品的峰面積如表2所示，按峰面積計算得標樣的RSD為0.40%.

表2 精密度實驗結(jié)果Table 2 Testing results of precision

2.4 重復(fù)性實驗

取6份同一批降血脂藥物樣品850mg（批號為20121106）制備供試品溶液，分別進樣10μL，記錄樣品的峰面積，計算得出左旋肉毒堿的質(zhì)量分數(shù)（見表3），由此得到RSD為0.80%.

表3 重復(fù)性實驗結(jié)果Table 3 Testing results of repeatability

2.5 回收率實驗

取降血脂藥物細粉（三批次各取幾?；旌暇鶆蚝笱兴椋芊Q取適量藥物加入25mL量瓶中，加入不同體積的0.4g／L的L－肉毒堿標準品，加入量分別為制劑中L－肉毒堿含量的80%、100%及120%，共制備成9份供試品溶液.分別進樣10μL，測試并記錄峰面積（見表4），計算得平均回收率為99.53%，RSD為0.31%.

表4 回收率實驗結(jié)果Table 4 Testing results of recoery test

2.6 樣品測定

取三批樣品，按樣品溶液制備方法制備樣品溶液.取L－肉毒堿標準品溶液和樣品溶液，各進樣三針，進樣量均為10μL，記錄色譜圖（見圖3和圖4）.得到的峰面積按外標法計算降血脂藥物中L－肉毒堿含量，結(jié)果三個批號樣品（20121025、20121106、20121115）中的L－肉毒堿含量分別為32.69%、33.75%和32.11%.

圖3 L－肉毒堿標準品的色譜圖Fig.3 Chromatogram of L－Carnitine standard substance

圖4 降血脂藥物樣品的色譜圖Fig.4 Chromatogram of lipid－lowing drug

2.7 討論

在預(yù)實驗中使用紫外分光光度計掃描標準品和樣品溶液，排除藥物中其他發(fā)光物質(zhì)的干擾，選定了測定波長；然后參考文獻［3，6，9］進行色譜柱的選擇.首先對Kromasil氨基柱和waters C18柱進行了比較，實驗表明，用流動相：乙腈∶KH2PO4＝65∶35，Kromasil氨基柱能將L－肉毒堿與其他雜質(zhì)進行很好的分離，出峰時間較合適（8min左右），且峰形較好；而采用waters C18柱，無論如何調(diào)節(jié)流動相比例，出峰時間均在2 min以內(nèi)，不能將L－肉毒堿與溶劑峰或其他雜質(zhì)峰進行很好的分離，所以本實驗選擇Kromasil柱為分析柱.與此前文獻比較，雖然相似的測定方法較多，但采用氨基柱的尚未見到，且流動相組成也未見有相似的.

3 結(jié)論

本文作者以L－肉毒堿為指標進行了測定方法的研究，色譜條件采用Kromasil NH2柱為色譜柱，以乙腈∶KH2PO4＝65∶35為流動相，流速為1.0mL／min，檢測波長為205nm.方法學驗證的結(jié)果顯示，本方法具有較高的準確度，保留時間長短適宜，重復(fù)性和再現(xiàn)性均比較好，且操作簡單，可用于降血脂藥物中L－肉毒堿含量的測定和相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量的控制.

［1］向忠權(quán)，蒲國榮，韋志明，等.左旋肉堿的合成與應(yīng)用［J］.化工技術(shù)與開發(fā)，2013，42（2）：15－21.

［2］楊 敏，牟金金，柳汝明，等.左旋肉堿用于減肥的系統(tǒng)評價［J］.中國藥房，2012，23（2）：147－149.

［3］祝偉霞，楊冀州，劉亞風，等.保健品中左旋肉堿的反相高效液相色譜法測定［J］.分析測試學報，2008，27（10）：1124－1127.

［4］胡曉娟，張 錦，趙 闐.反相高效液相色譜法測定保健品中左旋肉堿的含量［J］.光譜實驗室，2011，28（2）：743－746.

［5］李春籬，吳超偉，滕 忠，等.HPLC法測定甘之肖口服液中左旋肉堿的含量［J］.中國藥師，2011，14（6）：893－894.

［6］徐連明，王振中，畢宇安.HPLC法測定減肥膠囊中左旋肉堿的含量［J］.海峽藥學，2009，21（11）：46－47.

［7］賀稚非，王勇德.新型營養(yǎng)劑L－肉堿的檢測研究［J］.肉類工業(yè)，2000，229（7）：32－34.

［8］中華人民共和國國家標準.GB／T17787－1999食品添加劑左旋肉堿［S］.北京：國家質(zhì)檢總局，國家標準化管理委員會，1999.

［9］甘賓賓，黎少豪.HPLC法測定保健食品中左旋肉堿含量的研究［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010，20（7）：1688－1699.