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降血脂藥物中L-肉毒堿的高效液相色譜法測定

2014-10-11 06:20:10李景華趙炎蔥
化學研究 2014年4期
關(guān)鍵詞:肉堿降血脂肉毒

李景華,趙炎蔥,韓 光

(1.河南大學 天然藥物與免疫工程重點實驗室,河南 開封475001; 2.河南大學 第一附屬醫(yī)院,河南 開封475001;3.河南大學 藥學院,河南 開封475001)

L-肉毒堿(L-Carnitine)亦稱維生素BT,其化學式為C7H15O3N,相對分子質(zhì)量為162.2,是人類必需的營養(yǎng)物質(zhì),具有抗心肌缺血,抗心率失常,促進脂類代謝,降低血脂,治療肥胖等作用[1-2],由此成為研究的熱點.近些年,市場上出現(xiàn)了多種以L-肉毒堿為主要成分的降血脂藥物.L-肉毒堿的檢測方法主要有:高效液相色譜法[3-6],酶技術(shù)測定法[7],滴定法[8]等.滴定法較為粗放,很難測出L-肉毒堿的準確含量;酶技術(shù)測定法主要用于血液制品;液相色譜法具有操作簡便,準確度高等優(yōu)點,因此被廣泛用于L-肉毒堿的分析.已報道的液相色譜法中均采用C18柱[3-6],本課題組也在本藥品測定中利用這些方法進行了預(yù)實驗,但出現(xiàn)保留時間短,分離度不好,峰形差等現(xiàn)象,其原因可能是L-肉毒堿的極性較大,極易溶于水.氨基柱兼具正相與反相柱的性質(zhì),具有適當?shù)臉O性,對L-肉毒堿具有較適當?shù)谋A魰r間,且峰形較好.本文采用HPLC法,利用氨基柱對降血脂藥物中的L-肉毒堿的含量進行了測定,結(jié)果表明,該測試方法操作簡單,準確度高,為有效控制該類含L-肉毒堿的降血脂藥物質(zhì)量提供了依據(jù).

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC 2010A高效液相色譜儀(日本島津公司,LC 2010四元體系混合泵,LC 2010紫外檢測器,CLASS VP色譜工作站),KQ 300CDE型數(shù)控超聲波發(fā)生器(昆山市超聲儀器有限公司);AG135電子天平(梅特勒-托利多公司).

L-肉毒堿標準品(中國藥品生物制品檢定所,批號為1105072-201204,純度≥99.65%),降血脂藥物(市售,批號為20121025、20121106、20121115,主要由銀杏提取物、L-肉毒堿和紅曲粉及β-環(huán)糊精組成,制劑規(guī)格0.3g),乙腈為色譜純(天津四友化學試劑有限公司);KH2PO4及NaOH均為分析純;水為二次蒸餾水.

1.2 色譜條件

色譜柱:Kromasil氨基柱(250mm×4.6mm,5μm);流動相:乙腈∶KH2PO4溶液(6.81g/L,NaOH調(diào)至pH=4.7)=65∶35;流速:1.0mL/min;柱溫:30℃.

測定波長的選擇:取L-肉毒堿標準品溶液適量,在190~800nm波長范圍內(nèi)進行掃描,發(fā)現(xiàn)205nm處有最大吸收,故選擇205nm作為檢測波長.

1.3 標準品溶液的配制

準確稱取4mgL-肉毒堿標準品置于10mL容量瓶中,加入流動相適量,超聲溶解,室溫冷卻;搖勻,用流動相定容至刻度;用0.45μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液即得.

1.4 樣品溶液的配制

取降血脂藥物適量,除去膠囊殼,取出內(nèi)容物,碾碎,混勻;精密稱取粉末30mg加入25mL容量瓶中,加入流動相適量,超聲溶解,冷卻;搖勻,用流動相定容至刻度;用0.45μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液即得樣品溶液.

2 結(jié)果與討論

2.1 標準曲線的建立

取L-肉毒堿標準品溶液,分別采用0.5、5、15、20和25mL進樣,記錄得色譜圖(圖1),對應(yīng)的峰面積分別為8 542、84 097、252 192、336 583、421 565.以進樣量為橫坐標,以峰面積為縱坐標作回歸曲線,得回歸方程y=16 848.98x-125.89,(r=0.999 9)(圖2).結(jié)果表明,當L-肉毒堿的濃度為0.4g/L時,其注射體積在0.5~10mL范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系.

圖1 L-肉毒堿標樣的色譜圖Fig.1 Chromatograms of standard L-camitine conten

圖2 回歸曲線圖Fig.2 Regression curve

2.2 穩(wěn)定性實驗

取樣品溶液(批號為20121106),分別在0、1、2、4、8、12、24h后進樣,進樣量為10μL.記錄樣品的峰面積,計算得到L-肉毒堿的質(zhì)量分數(shù)(表1),并由此計算出質(zhì)量分數(shù)的RSD為0.80%,表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定.

表1 穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 1 Testing results of stability

2.3 精密度實驗

取L-肉毒堿標樣溶液(0.4g/L),連續(xù)進樣6次,進樣量均為10μL.測得樣品的峰面積如表2所示,按峰面積計算得標樣的RSD為0.40%.

表2 精密度實驗結(jié)果Table 2 Testing results of precision

2.4 重復(fù)性實驗

取6份同一批降血脂藥物樣品850mg(批號為20121106)制備供試品溶液,分別進樣10μL,記錄樣品的峰面積,計算得出左旋肉毒堿的質(zhì)量分數(shù)(見表3),由此得到RSD為0.80%.

表3 重復(fù)性實驗結(jié)果Table 3 Testing results of repeatability

2.5 回收率實驗

取降血脂藥物細粉(三批次各取幾?;旌暇鶆蚝笱兴椋芊Q取適量藥物加入25mL量瓶中,加入不同體積的0.4g/L的L-肉毒堿標準品,加入量分別為制劑中L-肉毒堿含量的80%、100%及120%,共制備成9份供試品溶液.分別進樣10μL,測試并記錄峰面積(見表4),計算得平均回收率為99.53%,RSD為0.31%.

表4 回收率實驗結(jié)果Table 4 Testing results of recoery test

2.6 樣品測定

取三批樣品,按樣品溶液制備方法制備樣品溶液.取L-肉毒堿標準品溶液和樣品溶液,各進樣三針,進樣量均為10μL,記錄色譜圖(見圖3和圖4).得到的峰面積按外標法計算降血脂藥物中L-肉毒堿含量,結(jié)果三個批號樣品(20121025、20121106、20121115)中的L-肉毒堿含量分別為32.69%、33.75%和32.11%.

圖3 L-肉毒堿標準品的色譜圖Fig.3 Chromatogram of L-Carnitine standard substance

圖4 降血脂藥物樣品的色譜圖Fig.4 Chromatogram of lipid-lowing drug

2.7 討論

在預(yù)實驗中使用紫外分光光度計掃描標準品和樣品溶液,排除藥物中其他發(fā)光物質(zhì)的干擾,選定了測定波長;然后參考文獻[3,6,9]進行色譜柱的選擇.首先對Kromasil氨基柱和waters C18柱進行了比較,實驗表明,用流動相:乙腈∶KH2PO4=65∶35,Kromasil氨基柱能將L-肉毒堿與其他雜質(zhì)進行很好的分離,出峰時間較合適(8min左右),且峰形較好;而采用waters C18柱,無論如何調(diào)節(jié)流動相比例,出峰時間均在2 min以內(nèi),不能將L-肉毒堿與溶劑峰或其他雜質(zhì)峰進行很好的分離,所以本實驗選擇Kromasil柱為分析柱.與此前文獻比較,雖然相似的測定方法較多,但采用氨基柱的尚未見到,且流動相組成也未見有相似的.

3 結(jié)論

本文作者以L-肉毒堿為指標進行了測定方法的研究,色譜條件采用Kromasil NH2柱為色譜柱,以乙腈∶KH2PO4=65∶35為流動相,流速為1.0mL/min,檢測波長為205nm.方法學驗證的結(jié)果顯示,本方法具有較高的準確度,保留時間長短適宜,重復(fù)性和再現(xiàn)性均比較好,且操作簡單,可用于降血脂藥物中L-肉毒堿含量的測定和相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量的控制.

[1]向忠權(quán),蒲國榮,韋志明,等.左旋肉堿的合成與應(yīng)用[J].化工技術(shù)與開發(fā),2013,42(2):15-21.

[2]楊 敏,牟金金,柳汝明,等.左旋肉堿用于減肥的系統(tǒng)評價[J].中國藥房,2012,23(2):147-149.

[3]祝偉霞,楊冀州,劉亞風,等.保健品中左旋肉堿的反相高效液相色譜法測定[J].分析測試學報,2008,27(10):1124-1127.

[4]胡曉娟,張 錦,趙 闐.反相高效液相色譜法測定保健品中左旋肉堿的含量[J].光譜實驗室,2011,28(2):743-746.

[5]李春籬,吳超偉,滕 忠,等.HPLC法測定甘之肖口服液中左旋肉堿的含量[J].中國藥師,2011,14(6):893-894.

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