劉傳榮，陳思浩，鄭玉林，陳玉雙，楊秋杰，周超，朱同賀，樓建中

（1上海工程技術(shù)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，上海 201620；2上海新亞藥業(yè)有限公司技術(shù)中心，上海 201203；3北卡羅蘭納農(nóng)工州立大學(xué)化工與機(jī)械工程學(xué)院，NC 27411，USA）

在科學(xué)實(shí)驗(yàn)的條件優(yōu)化中，線性回歸分析可以利用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出因素與指標(biāo)（即響應(yīng)值）之間的回歸方程，但要求數(shù)據(jù)量較大，耗時(shí)耗資，且只討論一種因素的影響，無(wú)法考慮幾種因素的綜合作用；正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)可同時(shí)考慮幾種因素，并尋找最佳因素水平組合，但它不能在給出的整個(gè)區(qū)域上找到因素和響應(yīng)值之間的一個(gè)明確的函數(shù)表達(dá)式即回歸方程，從而無(wú)法找到整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值。因此，一種試驗(yàn)次數(shù)少、周期短、求得的回歸方程精度高、能充分反映多種因素間交互作用的多元優(yōu)化方法——響應(yīng)面分析法[1-2]成為本文采用的方法。響應(yīng)面分析法在多個(gè)科學(xué)領(lǐng)域多有使用，能夠通過回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，同時(shí)還可以直觀地表達(dá)出各因素間的交叉作用。

近年來，海綿在藥學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān)注，主要研究方向是作為傷口敷料[3]、組織工程支架材料等。海綿醫(yī)用敷料[4-8]是醫(yī)用敷料的一種，是一類彈性、多孔的固體材料。它不僅具有傳統(tǒng)醫(yī)用敷料[9]保護(hù)傷口的作用，還具有各種不同的物理、化學(xué)性能以及良好的生物性能。例如海綿醫(yī)用敷料具有較好的吸水性、保濕性、耐酸耐堿性、滅菌性和生物相容性等特性，可以減少感染和促進(jìn)傷口愈合，且能較好地吸收滲出液和藥液，不會(huì)造成二次傷害，可減輕患者疼痛。

海綿劑系由親水性膠體溶液經(jīng)發(fā)泡、固化、凍干、滅菌而制成的一種海綿狀固體制劑，常用作創(chuàng)面或外科手術(shù)輔助止血?jiǎng)10-12]。海綿的制備方法及研究進(jìn)展在文獻(xiàn)資料中已有大量報(bào)道，本研究將響應(yīng)面分析[13-14]法首次應(yīng)用于復(fù)合海綿材料的制備工藝中，以期對(duì)復(fù)合海綿的開發(fā)利用提供理論指導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)選擇殼聚糖、海藻酸鈉、透明質(zhì)酸鈉3種輔料制備海綿多孔材料，可同時(shí)利用三者的優(yōu)點(diǎn)，避免三者在敷料方面使用的不足，既可保證殼聚糖的可降解性、滅菌性和較好的機(jī)械強(qiáng)度，又可以利用海藻酸鈉較好的吸水性和透明質(zhì)酸鈉的生物相容性。殼聚糖分子鏈上具有伯氨基，海藻酸鈉和透明質(zhì)酸鈉的分子鏈上都具有羧基，殼聚糖是通過靜電作用與海藻酸鈉和透明質(zhì)酸鈉結(jié)合形成的聚電解質(zhì)復(fù)合物[15]。殼聚糖加入透明質(zhì)酸鈉材料內(nèi)，既可避免由透明質(zhì)酸鈉的溶解性較好，導(dǎo)致的存留時(shí)間短，也可以使殼聚糖顯示出更強(qiáng)的抗水解作用[16]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

殼聚糖（CS，脫乙酰度 80.0～95.0）、海藻酸鈉（SA，化學(xué)純）、乙酸（冰乙酸），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；透明質(zhì)酸鈉（SH），阿拉丁試劑（上海）有限公司。

真空冷凍干燥箱，德國(guó) CHRiST；電子剝離試驗(yàn)機(jī)（BLD-200N）、傅里葉轉(zhuǎn)變紅外分光光度計(jì)（Nicolet AVATAR 370型），美國(guó)Thermo Fisher公司；掃描電子顯微鏡（JSM-5600LV），日本 JEOL公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9123A），上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電動(dòng)攪拌機(jī)（RW20 DS25），德國(guó) IKA公司。

1.2 方法

1.2.1 殼聚糖復(fù)合海綿制備工藝流程

工藝流程見圖1。

圖1 殼聚糖復(fù)合海綿制備工藝流程

1.2.2 海綿復(fù)合材料的拉伸強(qiáng)度測(cè)試

根據(jù)GB/T2792—1998所述，根據(jù)試驗(yàn)要求，用相應(yīng)寬度的取樣刀制取試樣，選擇試驗(yàn)所需的試驗(yàn)速度150 mm/min使用BLD-200N電子剝離試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行拉伸強(qiáng)度測(cè)試。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合海綿材料制備過程中的單因素影響

在進(jìn)行響應(yīng)面分析之前，應(yīng)先通過單因素實(shí)驗(yàn)來選擇實(shí)驗(yàn)因素與水平[17-18]。在本實(shí)驗(yàn)中影響海綿拉伸強(qiáng)度的因素很多，如殼聚糖[19]與海藻酸鈉[20]的配比、透明質(zhì)酸鈉[21]的濃度、電機(jī)攪拌速度、冷凍干燥的時(shí)間等。本實(shí)驗(yàn)采用冷凍干燥法，將海綿材料冷凍干燥至恒重，避免了由于含水量不同對(duì)拉伸強(qiáng)度的影響。

2.1.1 殼聚糖與海藻酸鈉的配料比

本實(shí)驗(yàn)中控制透明質(zhì)酸鈉的濃度和電機(jī)攪拌速度不變，測(cè)定不同殼聚糖與海藻酸鈉的物料配比條件下制得的海綿樣品的拉伸強(qiáng)度，結(jié)果如圖2所示。

由圖2所示，在透明質(zhì)酸鈉濃度與電機(jī)攪拌速度一定的情況下，殼聚糖與海藻酸鈉的配比為4∶1時(shí)，復(fù)合海綿材料的拉伸強(qiáng)度最大，因此可將殼聚糖與海藻酸鈉的配比范圍從4∶1左右延伸，即可確定此因素的“水平”。如表1，該因素的三水平取值為 3∶1、4∶1、5∶1。

圖2 殼聚糖與海藻酸鈉的配料比對(duì)拉伸強(qiáng)度的影響

2.1.2 透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

本實(shí)驗(yàn)中控制殼聚糖與海藻酸鈉的物料配比為4∶1和電機(jī)攪拌速度不變，測(cè)定不同透明質(zhì)酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的條件下制得的海綿樣品的拉伸強(qiáng)度，結(jié)果如圖3所示。

如圖3所示，透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在15%時(shí)拉伸強(qiáng)度最大，因此可將透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從15%向左右延伸，即可確定此因素的“水平”。如表1，該因素的三水平取值為10%、15%、20%。

2.1.3 電機(jī)攪拌速度對(duì)拉伸強(qiáng)度的影響

本實(shí)驗(yàn)中控制殼聚糖與海藻酸鈉的物料配比為4∶1和透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%不變，測(cè)定不同電機(jī)攪拌速度條件下制得的海綿樣品的拉伸強(qiáng)度，結(jié)果如圖4所示。

如圖4所示，電機(jī)攪拌速度為500 r/min時(shí)，海綿材料的拉伸強(qiáng)度最大，此后在700～900 r/min過程中拉伸強(qiáng)度有增大趨勢(shì)，這是由于隨著電機(jī)攪拌速度增加剪切力增大海綿的結(jié)構(gòu)更加密集。但是與此同時(shí)海綿孔結(jié)構(gòu)孔徑更加小，不利于后續(xù)應(yīng)用，故此時(shí)500 r/min為最佳攪拌速度。因此可將攪拌速度 500 r/min向左右延伸，即可確定此因素的“水平”。如表1，該因素的三水平取值為400 r/min、500 r/min、600 r/min。

圖3 透明質(zhì)酸鈉的含量對(duì)拉伸強(qiáng)度的影響

圖4 電機(jī)攪拌速度對(duì)拉伸強(qiáng)度的影響

2.2 采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化海綿制備工藝

2.2.1 響應(yīng)面分析因素水平的選取

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合2.1節(jié)中單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取殼聚糖與海藻酸鈉配比、透明質(zhì)酸鈉含量、電機(jī)攪拌速度對(duì)作為復(fù)合海綿材料的拉伸強(qiáng)度的影響顯著的3個(gè)因素，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法[22-23]，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

2.2.2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

以殼聚糖與海藻酸鈉的物料比A、透明質(zhì)酸鈉濃度B、轉(zhuǎn)速C為自變量，以符合海綿材料的拉伸強(qiáng)度為響應(yīng)值（Y），進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)。試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

2.2.3 多元二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果通過Design-Expert軟件程序進(jìn)行二次回歸響應(yīng)面分析，建立多元二次響應(yīng)面模型：

各因素的方差分析見表3。

模型的F值145.55意味著回歸模型顯著（P＜0.05）。失擬值0.0620表明失擬項(xiàng)（Lack of Fit）不顯著，模型的擬合性較好。從表 3中可以看出，A（電機(jī)攪拌速度）、B（透明質(zhì)酸鈉的含量）、C（殼聚糖與海藻酸鈉的配比）、AB、AC、A2、B2、C2是顯著的模型項(xiàng)（P＜0.05）；而BC的Prob＞F值大于0.1000，表明模型項(xiàng)不顯著（BC）。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平

表2 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析

電機(jī)攪拌速度和透明質(zhì)酸鈉含量的影響較大，殼聚糖與海藻酸鈉的配比影響較小，其中電機(jī)攪拌速度和透明質(zhì)酸鈉含量已達(dá)到極著顯著水平。

由以上分析得出，本試驗(yàn)中AB的交互作用和AC的交互作用影響顯著，試驗(yàn)結(jié)果見圖5、圖6，BC的交互作用見圖7。

由圖5可以看出，當(dāng)透明質(zhì)酸鈉含量處在某一固定水平時(shí)，轉(zhuǎn)速對(duì)制劑拉伸強(qiáng)度的影響均出現(xiàn)了由低到高再由高到低的趨勢(shì)，即在試驗(yàn)范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)速對(duì)拉伸強(qiáng)度的影響出現(xiàn)了最優(yōu)點(diǎn)。同樣，當(dāng)轉(zhuǎn)速一定時(shí)，透明質(zhì)酸鈉的含量對(duì)拉伸強(qiáng)度的影響也出現(xiàn)了最優(yōu)點(diǎn)。兩者對(duì)轉(zhuǎn)速的影響都比較明顯，由此可以看出，在轉(zhuǎn)速及透明質(zhì)酸鈉含量的交互作用中，兩個(gè)因素對(duì)拉伸強(qiáng)度的影響都很大。

由圖6可以看出，當(dāng)m(CS)/m(SA)比處在某一固定水平時(shí)，轉(zhuǎn)速對(duì)制劑拉伸強(qiáng)度的影響出現(xiàn)了最高點(diǎn)，是一個(gè)由低到高再由高到低的過程，即在試驗(yàn)范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)速對(duì)拉伸強(qiáng)度的影響出現(xiàn)了最優(yōu)點(diǎn)。但在轉(zhuǎn)速一定時(shí)，m(CS)/m(SA)配比對(duì)拉伸強(qiáng)度的影響相比之下并不明顯。綜合來看，在轉(zhuǎn)速及m(CS)/m(SA)配比的交互作用中，轉(zhuǎn)速對(duì)拉伸強(qiáng)度的影響大于 m(CS)/m(SA)配比的影響，是主效應(yīng)因子。

由圖7可以看出，當(dāng)CS/SA配比處在某一固定水平時(shí)，透明質(zhì)酸鈉含量對(duì)制劑拉伸強(qiáng)度的影響比較明顯，均有最高點(diǎn)的出現(xiàn)。而在透明質(zhì)酸鈉含量一定時(shí)，CS/SA配比對(duì)拉伸強(qiáng)度的影響并不明顯，近似成一條直線。綜合來看，在透明質(zhì)酸鈉含量及CS/SA配比的交互作用中，透明質(zhì)酸鈉對(duì)拉伸強(qiáng)度的影響大于CS/SA配比的影響，是主效應(yīng)因子。

2.2.4 最優(yōu)方案及其表征

由 Expert-Design軟件得到的最佳選擇和通過實(shí)驗(yàn)的比較結(jié)果如表4。

（1）紅外光譜分析（FTIR） Nicolet AVATAR 370型 FTIR紅外分光光度計(jì)分別對(duì) CS、SH、SA及殼聚糖復(fù)合海綿進(jìn)行官能團(tuán)測(cè)試，掃描次數(shù)為32次，分辨率為2 cm?1。如圖8所示。

從圖8和表5可以看出，在3250～3600 cm?1處為—OH鍵吸收峰，在2800～3000 cm?1處為 CH3和CH2的C—H伸縮振動(dòng)峰，在1500～1700 cm?1處為 C=O 伸縮振動(dòng)峰，在 1400 cm?1處左右為C—H 的彎曲振動(dòng)峰；在1150 cm?1處左右為C—N伸縮振動(dòng)峰；在1000～1100 cm?1處為C—O伸縮振動(dòng)峰。此外，海藻酸鈉 在1607 cm?1處的C=O伸縮振動(dòng)峰吸收峰在殼聚糖復(fù)合海綿中向低頻位移到1550 cm?1，向低波數(shù)方向偏移了57 cm?1，說明發(fā)生了靜電作用形成了復(fù)合物。透明質(zhì)酸鈉在 1630 cm?1處的C=O伸縮振動(dòng)峰吸收峰在殼聚糖復(fù)合海綿中向低頻位移到1550 cm?1，向低波數(shù)方向偏移了80 cm?1，說明發(fā)生了靜電作用形成了復(fù)合物。

圖5 攪拌速度A與透明質(zhì)酸鈉含量B的交叉影響的響應(yīng)面及等高線圖

圖6 攪拌速度A和殼聚糖與海藻酸鈉的物料比C的交叉影響的響應(yīng)面及等高線圖

圖7 透明質(zhì)酸鈉含量B及殼聚糖與海藻酸鈉物料比C的交叉影響的響應(yīng)面及等高線圖

圖8 紅外吸收光譜圖

表4 最佳方案表

（2）掃描電鏡分析（SEM） 將制備好的殼聚糖復(fù)合海綿進(jìn)行噴金處理，在掃描電鏡下進(jìn)行觀察記錄。

圖9 SEM電鏡掃描圖

表5 吸收峰及其范圍

通過電鏡放大分析后，可以看到殼聚糖-海藻酸鈉-透明質(zhì)酸鈉海綿表面擁有致密層，且具備均勻的多孔與多層次的結(jié)構(gòu)，孔徑適中，是結(jié)構(gòu)良好的海綿狀材料，并且照片中有明顯的交聯(lián)現(xiàn)象。

（3）吸水性能測(cè)試 對(duì)采用最優(yōu)方案制備的海綿進(jìn)行吸水性能測(cè)試，海綿自重m1為0.0938 g，海綿充分吸收水后的質(zhì)量m2為5.6592 g，由此，吸水率Q=( m2? m1)/m1×100%為 5933.3%。

（4）保水性能測(cè)試 對(duì)采用最優(yōu)方案制備的海綿進(jìn)行吸水性能測(cè)試，海綿自重m1為0.1058 g，海綿充分吸收水后又經(jīng)充分離心后的質(zhì)量 m2'為2.6726 g，由此，保水率 Q'=( m2'? m1)/m1為 2426.1%。

3 結(jié) 論

（1）本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法直觀分析了電機(jī)攪拌速度、透明質(zhì)酸鈉含量及殼聚糖海藻酸鈉配比幾個(gè)因素對(duì)復(fù)合海綿狀拉伸強(qiáng)度的影響及各因素的交互影響。

（2）響應(yīng)面分析表明電機(jī)攪拌速度和透明質(zhì)酸鈉含量對(duì)復(fù)合海綿狀的拉伸強(qiáng)度影響較大，已達(dá)到極著顯著水平。殼聚糖與海藻酸鈉的配比相比之下影響較小。

（3）優(yōu)化出的最佳工藝條件：電機(jī)攪拌速度為541 r/min，透明質(zhì)酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14%，殼聚糖與海藻酸鈉的配比為 3.71∶1，得到理論拉伸強(qiáng)度為0.1652 MPa，實(shí)際拉伸強(qiáng)度為0.1709 MPa。

（4）實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該海綿材料具有均勻的多孔與多層次的結(jié)構(gòu)，吸水、保水性能均良好。

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