劉東梅，楊云云，杜俊潮，楊紅艷，郭 惠，王昌利，馬曉軍

（陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 咸陽712046）

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸的干燥近成熟果實。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦辛、性溫?zé)?、有小毒，具有散寒止痛、降逆止吐、助陽止瀉之功效[1］。吳茱萸的主要活性成分為生物堿，其中吳茱萸堿（分子結(jié)構(gòu)見圖1）被認為是吳茱萸生物堿的主要藥效成分之一，具有抗腫瘤、降壓、調(diào)節(jié)體溫、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗炎、抗過敏等作用[2－4］。關(guān)于吳茱萸堿的抗腫瘤活性，近年來國內(nèi)外已有一些報道[5－8］。MTT法是目前美國國立腫瘤研究所推行的抗癌藥物體外篩選法，用于測定活細胞及細胞增殖[9］。作者前期研究了吳茱萸堿的體內(nèi)抗腫瘤活性[7］，為了進一步研究它的體外抗腫瘤活性，采用MTT法在不同的時間點檢測了不同濃度的吳茱萸堿對S180、H22、HepG2腫瘤細胞的抑制情況。

圖1 吳茱萸堿的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structural formula of evodiamine

1 實驗

1.1 實驗細胞株和培養(yǎng)基

小鼠S180腹水肉瘤細胞、小鼠H22腹水型肝癌細胞、人源HepG2肝癌細胞和人血管內(nèi)皮細胞ECV304，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。

完全培養(yǎng)基：RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司）85%，胎牛血清（Hyclone）10%，雙抗5%。

1.2 藥物及試劑

吳茱萸堿為合成所得[10］；四甲基偶氮唑鹽（MTT），Amresco公司；二甲基亞砜（分析純），鎮(zhèn)江市化學(xué)試劑廠；順鉑粉劑（cisplatin，DDP），規(guī)格：每支20 mg，山東齊魯制藥有限公司。

1.3 MTT比色法[11－12］

取對數(shù)生長期細胞，制備成濃度為2×105個·mL－1的細胞懸液。接種于96孔培養(yǎng)板，每孔180 μL。24h后，每孔中加入20μL不同濃度（640μg·mL－1、320μg·mL－1、160μg·mL－1、80μg·mL－1、40μg·mL－1）吳茱萸堿溶液，使藥物的最終濃度為64 μg·mL－1、32μg·mL－1、16μg·mL－1、8μg·mL－1、4μg·mL－1。同時設(shè)空白組（不加藥物和細胞，其它與用藥組相同）、陽性對照組（順鉑DDP，終濃度4μg·mL－1）、對照組（加入細胞，不加藥物），每組設(shè)4個復(fù)孔培養(yǎng)。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入20μL MTT，培養(yǎng)4h。貼壁細胞直接吸取出孔中上清液后加入150μL DMSO（懸浮細胞將細胞移至EP管中，離心棄上清，加入150μL DMSO），振蕩10min后用酶標(biāo)儀在492 nm處檢測OD值。所有實驗在相同條件下重復(fù)3次，按下式計算細胞抑制率：

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果以（珚x±s），采用Two－way ANOVA方差分析進行兩組及多組樣本均數(shù)的比較，所得數(shù)據(jù)由graphpad prism5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 吳茱萸堿對S180肉瘤細胞的抑制率（表1 ）

表1 不同濃度的吳茱萸堿在不同的時間點對S180肉瘤細胞的抑制率（珔x±s）Tab.1 The inhibition rate of evodiamine at different concentrations in 24h，48h，72hto S180cell lines

由表1 可知，吳茱萸堿在不同的作用時間對S180肉瘤細胞均呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，隨著濃度的增大，抑制率逐漸提高。在濃度為4μg·mL－1、8μg·mL－1時，吳茱萸堿對S180肉瘤細胞作用24h、48h、72h后，抑制率分別為14.18%、16.24%、19.37%和24.63%、24.77%、38.05%，其抑制率隨著時間的延長而持續(xù)提高，說明在較低濃度下吳茱萸堿對S180肉瘤細胞的抑制率與時間呈正相關(guān)；當(dāng)濃度大于16μg·mL－1時，作用48h和72h，抑制率相差不大，說明在48h時已經(jīng)達到了穩(wěn)定抑制率，繼續(xù)延長作用時間，抑制率沒有明顯提高。因此，吳茱萸堿對S180肉瘤細胞而言，屬于濃度依賴型藥物[12］。吳茱萸堿與對照組比較，作用極其顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。與經(jīng)典的抗癌藥物順鉑比較，高濃度的吳茱萸堿對S180肉瘤細胞的抑制率比4μg·mL－1的順鉑高。

2.2 吳茱萸堿對H22肝癌細胞的抑制率（表2 ）

表2 不同濃度的吳茱萸堿在不同的時間點對H22肝癌細胞的抑制率（珔x±s）Tab.2 The inhibition rate of evodiamine at different concentrations in 24h，48h，72hto H22cell lines

由表2 可知，吳茱萸堿在不同的作用時間對H22肝癌細胞均呈現(xiàn)劑量依賴性，隨著濃度的增大，抑制率逐漸提高。但吳茱萸堿沒有時間相關(guān)性，各濃度在24h時即達到較為穩(wěn)定的抑制率，延長作用時間，抑制率無明顯變化。吳茱萸堿與對照組比較，作用極其顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。與經(jīng)典的抗癌藥物順鉑比較，在濃度為4μg·mL－1，作用24h、48h時，吳茱萸堿與4μg·mL－1的順鉑對 H22肝癌細胞的抑制作用相當(dāng)；但作用72h時，4μg·mL－1的順鉑對H22肝癌細胞的抑制作用比同濃度的吳茱萸堿稍高，高濃度的吳茱萸堿對H22肝癌細胞的抑制率比4μg·mL－1的順鉑高。

2.3 吳茱萸堿對HepG2肝癌細胞的抑制率（表3 ）

由表3 可知，吳茱萸堿對HepG2肝癌細胞既呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，又呈現(xiàn)時間依耐性。隨濃度增大和時間延長，抑制率逐漸提高。吳茱萸堿與對照組比較，作用極其顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。與經(jīng)典的抗癌藥物順鉑比較，濃度為4μg·mL－1的吳茱萸堿作用24h、48h時，對 HepG2肝癌細胞的抑制作用比4μg·mL－1的順鉑稍差，但高濃度時，吳茱萸堿對HepG2肝癌細胞的抑制率比4μg·mL－1的順鉑高。作用72h時，濃度為32μg·mL－1、64μg·mL－1的吳茱萸堿對HepG2肝癌細胞的抑制率比4μg·mL－1的順鉑高，其它濃度的吳茱萸堿都比4μg·mL－1的順鉑的抑制率低。

表3 不同濃度的吳茱萸堿在不同的時間點對HepG2肝癌細胞的抑制率（珔x±s）Tab.3 The inhibition rate of evodiamine at different concentrations in 24h，48h，72hto HepG2cell lines

2.4 吳茱萸堿對ECV304細胞的抑制作用

為了進一步考察吳茱萸堿對正常細胞的毒副作用，研究了不同濃度（64μg·mL－1、32μg·mL－1、16 μg·mL－1、8μg·mL－1、4μg·mL－1）的吳茱萸堿在24h對人血管內(nèi)皮細胞ECV304的抑制作用，結(jié)果見表4。

表4 24h下不同濃度吳茱萸堿對ECV304細胞的抑制作用Tab.4 The inhibition effects of evodiamine at different concentrations in 24hto ECV304cell lines

由表4可知，不同濃度的吳茱萸堿對ECV304細胞作用24h后，有一定的傷害作用，且濃度越高傷害越大，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），半數(shù)抑制質(zhì)量濃度IC50為124.65μg·mL－1。

2.5 吳茱萸堿的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度IC50

通過回歸曲線可測得吳茱萸堿對S180、H22、HepG2細胞的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度，結(jié)果見表5 。

表5 吳茱萸堿對三種腫瘤細胞的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度（IC50）Tab.5 The IC50values of evodiamine to 3types of tumor cell lines

由表5 可知，吳茱萸堿作用24h時，對H22肝癌細胞的抑制作用相對較好，IC50值最小（17.49μg·mL－1）；作用48h時，對S180肉瘤細胞的抑制作用相對較好，IC50值最?。?7.54μg·mL－1）；作用72h時，對HepG2肝癌細胞的抑制作用相對較好，IC50值最?。?3.26μg·mL－1）。對同一種細胞不同時間點的IC50值進行比較發(fā)現(xiàn)，吳茱萸堿作用于S180肉瘤細胞72h時抑制作用最強；對 H22肝癌細胞，24h時抑制作用最強；對 HepG2肝癌細胞，72h時抑制作用最強。同時從IC50值也可以看出，吳茱萸堿對正常的人血管內(nèi)皮細胞ECV304也有一定的傷害作用；作用24 h后，IC50值為124.65μg·mL－1。提示吳茱萸堿有一定的細胞毒作用。

3 結(jié)論

采用MTT法在不同的時間點檢測了不同濃度的吳茱萸堿對S180肉瘤細胞、H22肝癌細胞、人源HepG2肝癌細胞的抑制作用。結(jié)果表明，吳茱萸堿在一定濃度下對三種腫瘤細胞有明顯的抑制作用，且隨藥物濃度的增大，抑制率逐漸增大，與正常組比較作用極其顯著。吳茱萸堿作用24h時，對H22肝癌細胞的生長抑制作用較好，IC50值最小（17.49μg·mL－1）；作用48h時，對S180肉瘤細胞的抑制作用相對較好，IC50值 最 小 （17.54μg·mL－1）；作 用 72h 時，對HepG2肝癌細胞的抑制作用最好，IC50值最?。?3.26 μg·mL－1）。

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