王石健，應(yīng)苗法

0 引言

絲裂霉素是頭狀鏈霉菌中分離得到的一種毒副作用少的抗代謝成分，具有苯醌、烏拉坦和乙烯亞胺3種有效基團(tuán)，在機(jī)體內(nèi)絲裂霉素中的苯酯還原成為雙功能烷化基團(tuán)，可使互補(bǔ)的DNA雙鍵之間產(chǎn)生交叉連接，選擇性抑制RNA合成，抑制增殖期DNA復(fù)制，對(duì)增殖各期細(xì)胞和靜止期細(xì)胞均有抑制作用［1］。臨床用于治療消化道癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌等多種腫瘤。絲裂霉素亦可抑制成纖維細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移，并阻止成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原物質(zhì)，同時(shí)可阻止血管的再生，其抗瘢痕效果優(yōu)于其他抗代謝藥，在眼科領(lǐng)域使用廣泛［2-3］。但是絲裂霉素在眼部的應(yīng)用也伴隨著較少見而嚴(yán)重的不良反應(yīng)［4］，主要有角膜水腫、角膜穿孔、眼部感染、鞏膜鈣化、鞏膜軟化、鞏膜潰瘍、虹膜炎、繼發(fā)性青光眼等。另外，絲裂霉素的穩(wěn)定性比較差，也限制了其應(yīng)用的進(jìn)一步推廣。為了克服現(xiàn)有絲裂霉素給藥系統(tǒng)的缺點(diǎn)，新型的絲裂霉素眼用給藥系統(tǒng)也在不斷的開發(fā)中［5-8］，包括新型滴眼劑、眼用膜劑、眼用溫敏凝膠、可降解植入劑等。藥物在角膜中的滲透特性對(duì)給藥后藥物在眼部的分布、作用與消除均有重要的影響，是眼部給藥系統(tǒng)設(shè)計(jì)時(shí)需要重點(diǎn)考慮的因素。本研究采用兔角膜為模型，使用水平式擴(kuò)散儀考察了絲裂霉素在離體角膜中的滲透特性，為絲裂霉素新型眼用給藥系統(tǒng)的開發(fā)提供參考。

1 方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器 高效液相色譜儀，配備G1310A泵，G1314A紫外檢測器，7255i手動(dòng)進(jìn)樣器，TC100柱溫箱(Agilient 1100，美國)，水平式擴(kuò)散池(AH-6，上海鍇凱科技有限公司，接受室與供應(yīng)室體積均為4 mL)，分析天平(AL204，梅特勒-托利多公司)。

1.1.2 試劑 絲裂霉素對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):130438-200502)，絲裂霉素注射液(浙江海正藥業(yè)，規(guī)格10 mg，批號(hào):120401)，谷胱甘肽氧化型(上海生工生物工程有限公司)，甲醇為色譜純(德國默克)，其余試劑均為分析純。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭兔(雄性，2 kg左右，浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)

1.2 色譜條件 色譜柱:Agilent Zorbax C18柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相:甲醇∶水 =70∶30，v/v，流速:1 mL/min，檢測波長:365 nm，柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:20 μL。

1.3 溶液制備 谷胱甘肽緩沖液的配制［9］:A液:氯化鈉12.4 g，氯化鉀0.716 g，磷酸二氫鈉0.206 g，碳酸氫鈉4.908 g，用水溶解并定容至1L;B液:谷胱甘肽氧化型0.184 g，氯化鈣0.23 g，氯化鎂0.318 g，葡萄糖1.8 g，用水溶解并定容至1 L。分別置4℃保存，臨用前混合。

精密稱取絲裂霉素對(duì)照品約10 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL，即得絲裂霉素的對(duì)照品貯備液。將對(duì)照品貯備液適當(dāng)稀釋即得絲裂霉素的對(duì)照品溶液。

1.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別取空白接受液、絲裂霉素對(duì)照品溶液和樣品溶液20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，考察釋放介質(zhì)及其他角膜浸出物質(zhì)對(duì)絲裂霉素的測定有無干擾。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線 用甲醇將絲裂霉素貯備液稀釋成濃度為 0.2、1、2、5、10、20 μg/mL 的溶液，分別進(jìn)樣，記錄峰面積。以峰面積(C)對(duì)濃度(C)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 回收率 分別取絲裂霉素貯備液適量，用空白接收液稀釋成濃度為1、5、10 μg/mL的溶液，HPLC測定，計(jì)算回收率。

1.7 精密度與穩(wěn)定性 分別取用空白接收液稀釋成濃度為 1、5、10 μg/mL 的絲裂霉素溶液，HPLC連續(xù)測定6次，記錄絲裂霉素的峰面積，計(jì)算RSD，考察精密度;取濃度為5 μg/mL的絲裂霉素溶液在溫室下12 h內(nèi)不同時(shí)間HPLC測定，記錄絲裂霉素的峰面積，計(jì)算RSD，考察穩(wěn)定性。

1.8 離體角膜滲透實(shí)驗(yàn)

1.8.1 離體角膜的制備 新西蘭兔耳緣靜脈注射空氣處死后，立即使用眼科鑷和手術(shù)刀分離角膜，除去鞏膜、虹膜、睫狀體等組織，置于4℃谷胱甘肽緩沖液中備用。

1.8.2 角膜滲透試驗(yàn) 取新鮮制備的離體角膜，置于水平式擴(kuò)散池的供應(yīng)室和接收室之間，角膜外側(cè)面朝向供應(yīng)室。在接受室內(nèi)加入4 mL谷胱甘肽緩沖液作為接收液，供應(yīng)室內(nèi)加入0.02%絲裂霉素溶液4 mL，水浴溫度設(shè)置34℃，磁力攪拌速度為 250 r/min。分別在試驗(yàn)開始后 1、2、3、4、6 h取樣1 mL，并補(bǔ)充等量同溫的新鮮接收液。樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，取續(xù)濾液HPLC測定峰面積，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度，計(jì)算累積透過量。以累積透過量對(duì)時(shí)間作圖，即得絲裂霉素在離體角膜的滲透曲線。

1.8.3 滲透特性分析 將所得絲裂霉素的滲透曲線按照不同的動(dòng)力學(xué)方程進(jìn)行擬合，考察其滲透特性。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性 絲裂霉素的系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。HPLC測試時(shí)間約17 min，絲裂霉素的保留時(shí)間約12.5 min，峰形良好，在絲裂霉素的保留時(shí)間處無其他雜質(zhì)干擾測定。

圖1 絲裂霉素的高效液相色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以絲裂霉素的峰面積A對(duì)濃度C作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線:A=28.081C+0.719，r=0.999 9，結(jié)果顯示，絲裂霉素在 0.2～20 μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，滿足測試要求。

2.3 回收率 絲裂霉素回收率的結(jié)果如表1所示，結(jié)果顯示，絲裂霉素在高中低各濃度的回收率良好，平均回收率為99.70%，符合測定要求。

2.4 精密度與穩(wěn)定性 低中高濃度絲裂霉素精密度試驗(yàn) RSD分別為 0.62%、0.22%、0.14%(n=6)。結(jié)果顯示絲裂霉素在各濃度下精密度良好。濃度為5 μg/mL的絲裂霉素在溫室下放置，分別于1、2、4、6、8、12 h 測定，RSD 為 0.89%。結(jié)果顯示絲裂霉素在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 角膜滲透試驗(yàn) 絲裂霉素在離體角膜中的滲透性能如圖2所示。

表1 絲裂霉素的回收率

圖2 絲裂霉素經(jīng)過角膜的滲透曲線(n=6)

2.6 分析 將絲裂霉素經(jīng)過角膜的滲透曲線按照不同的動(dòng)力學(xué)方程進(jìn)行擬合，結(jié)果如表2所示。其中，按照一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程擬合所獲得的相關(guān)系數(shù)r值最高，故認(rèn)為絲裂霉素在角膜的滲透符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。

表2 絲裂霉素滲透特性的擬合結(jié)果(n=6)

3 討論

絲裂霉素紫外吸收較高，一般常采用HPLCUV測定，即可達(dá)到精密度和檢測限的要求。有文獻(xiàn)報(bào)道使用梯度洗脫法［9］、緩沖鹽溶液作為流動(dòng)相［10］測定絲裂霉素，操作比較復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)條件要求較高。有報(bào)道稱使用甲醇和水作為流動(dòng)相效果良好［11］。本研究采用甲醇∶水(70∶30，v/v)作為流動(dòng)相，操作簡便，而且絲裂霉素在此流動(dòng)相下保留時(shí)間適中，峰形對(duì)稱，且無雜質(zhì)干擾，故使用此流動(dòng)相進(jìn)行分析。絲裂霉素在水中穩(wěn)定性差，降解較快［12］，故本實(shí)驗(yàn)的樣品在取樣后立即進(jìn)行測定。穩(wěn)定性試驗(yàn)的結(jié)果顯示絲裂霉素在12 h內(nèi)是穩(wěn)定的，滿足測試的要求。

考察藥物在離體角膜中的滲透性能，通常采用透皮擴(kuò)散池進(jìn)行試驗(yàn)。對(duì)于凝膠等半固體眼用制劑，通常采用直立式擴(kuò)散池進(jìn)行考察［13-14］。但是對(duì)于藥物溶液，若使用直立式擴(kuò)散池，由于角膜表面的液體流動(dòng)較慢，形成濃度較低的液層，會(huì)降低藥物的透角膜速度，故考察藥物溶液的角膜滲透特性時(shí)常采用水平式擴(kuò)散池［15］。本研究因此采用水平式擴(kuò)散池考察絲裂霉素的透角膜特性。

在離體角膜的滲透性研究中，通常采用谷胱甘肽緩沖液作為接收液的主要成分［16］，因?yàn)榻悄ぴ诖司彌_液中可維持活性長達(dá)6 h［17］。接受液不僅需要能夠維持角膜的活性，還需要有容納藥物的能力。為了保持在滲透試驗(yàn)過程中的漏槽條件，通常需要加入乙醇等物質(zhì)增加藥物在接受液中的溶解度［19］。由于絲裂霉素的水溶解性良好，在本實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)使用谷胱甘肽緩沖液即可滿足漏槽條件。

對(duì)于絲裂霉素在離體角膜中的滲透特性的方程擬合，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)是擬合方程的回歸系數(shù)?；貧w系數(shù)越大，說明擬合優(yōu)度越好，絲裂霉素越可能是按照此種方式透過角膜。本研究采用了三種藥物透過介質(zhì)常見的模型進(jìn)行擬合，結(jié)果顯示絲裂霉素經(jīng)角膜的滲透過程符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，說明絲裂霉素在角膜的滲透具有一定的時(shí)滯，但隨著時(shí)間的延長，絲裂霉素的滲透速率逐漸增加。這提示我們?cè)谠O(shè)計(jì)靶部位在眼內(nèi)的給藥系統(tǒng)時(shí)，應(yīng)設(shè)法延長絲裂霉素在淚液中的滯留時(shí)間;反之，設(shè)計(jì)作用于眼表的給藥系統(tǒng)時(shí)，則應(yīng)縮短絲裂霉素在淚液中的滯留時(shí)間，以免藥物進(jìn)入眼內(nèi)引起副作用。

由于制劑給藥于眼部后的實(shí)際情況比較復(fù)雜，影響因素較多，例如結(jié)膜囊容量有限、淚液引流引起制劑流失或稀釋等，離體角膜的滲透試驗(yàn)不能完全說明絲裂霉素在體內(nèi)經(jīng)角膜滲透的真實(shí)情況。

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