馬悅培 ， 楊 歡 ， 張軍民 ＊， 趙青余 ， 高紅亮

（1.中國農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 農業(yè)部華北動物遺傳資源與營養(yǎng)科學觀測實驗站，北京海淀 100193；2.華東師范大學，上海閔行 200062；3.甘肅農業(yè)大學，甘肅蘭州 730070；4.中國農業(yè)科學院世界農用林業(yè)中心 農用林業(yè)與可持續(xù)畜牧業(yè)聯(lián)合實驗室，北京海淀 100193）

蒙脫石是一種具有雙八面體層狀結構的天然納米級鋁硅酸鹽礦物質，因其具有較大的比表面積和層間可交換陽離子的存在，使蒙脫石具有吸附和交換性能，且其來源廣泛、價格低廉、性質穩(wěn)定，可作為抗菌金屬離子的理想載體材料（韓躍新等，2006）。蒙脫石對重金屬離子的吸附特性是當前科學領域的研究熱點，已有很多學者在這方面做了深入研究 （何宏平和郭九皋，1999）。孟艷麗（2011）研究蒙脫石、凹凸棒石及其復合物對斷奶仔豬腸道保護作用，結果表明這三種物質能夠降低斷奶仔豬腹瀉率，具有提高仔豬飼料轉化率的趨勢。謝仲權和張軍民（2009）認為，蒙脫石可通過對消化道內的重金屬、細菌以及有害氣體的強烈吸附作用起到對動物的保健作用。胡秀榮等（2002）在含細菌數(shù)約為1×107cfu/mL的人工腸液中，加入不同量的蒙脫石，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，計數(shù)菌落數(shù)。結果表明：蒙脫石對細菌無抑制或殺滅作用，蒙脫石對細菌的作用主要是吸附，且吸附力強弱與其帶電性有關中。許多重金屬離子和重金屬化合物有抗菌消毒的作用，特別是銀離子在低濃度下即具有較高生物活性。利用蒙脫石結構穩(wěn)定、吸附性強、離子交換容量大等特點，可將Cu2+、Ag+加載到其特殊結構中，制備出天然抗菌劑，從而將蒙脫石的吸附作用與重金屬離子的殺菌作用結合起來，添加到飼料中以充分發(fā)揮蒙脫石的有利作用。

本試驗以提純的蒙脫石為載體，制備載銅、載銀蒙脫石；對制備的四種載銅、載銀蒙脫石進行了X射線衍射（XRD）；以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌為指示菌，測定四種載銅、載銀蒙脫石的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），評價其抗菌性能，從而為載銅、載銀蒙脫石作為飼用抗生素的替代品和無機抗菌材料提供數(shù)據(jù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑 蒙脫石M1、蒙脫石M2均由中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所制備。

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，均由華東師范大學生命科學學院微生物學實驗室分離并保存。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基參考謝仲權和張軍民（2009）的方法：蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，牛肉浸出粉3～5 g/L。滅菌后，該培養(yǎng)基pH值應為7.2±0.2。

主要試劑有：鄰苯二甲酸氫鉀、氯化銨、硝酸銀、氫氧化鈉、甲醛、乙醇、亞甲基藍、酚酞、焦磷酸鈉、氨水、氯化鈣、鹽酸、硝酸銅等均為分析純試劑，由國藥集團、北京北化精細化學品公司、北京化學制劑有限公司等公司提供。

1.1.2 儀器與設備 臺式高速離心機（H-1650型，湖南湘儀）；Ag-S電極，Cu電極，甘汞電極（上海羅素）；精密酸度計（PHC-3CT型，上海大普）；磁力攪拌器（H01-1C型，上海梅穎浦）；恒溫水浴鍋（HHS型，上海博迅）；恒溫鼓風干燥箱（DHG-9070A1型，上海精宏）；培養(yǎng)箱（SPX-150B-2型，上海博迅）。

1.2 試驗方法

1.2.1 蒙脫石載銅、載銀試驗 載銅試驗條件為：90 ℃水浴，反應時間 6 h，固液比 1∶20，Cu（NO3）2濃度 0.05 mol/L，3000 r/min，離心 10 min，上清移入容量瓶，沉淀用去離子水洗滌數(shù)次，離心，每次

式中：V為溶液體積，mL；m為吸附劑用量，g；C0、C為吸附前后重金屬離子濃度，mol/L。

1.2.2 載銅、載銀蒙脫石X射線衍射 本試驗采用DmA1x12kW粉末衍射儀，石墨彎晶單色器和 CuKα（0.15418 nm）X 射線，管電壓 40 kV，管電流100 mA，掃描方式是 θ/2θ掃描，掃描速度為 8°（2θ）/分，采數(shù)步寬為 0.01°（2θ），環(huán)境溫度為（15.0±1）℃，濕度是（20.0±5）%。 試驗操作按照標準SY/T6210-1996進行，委托北京北達燕園微構分析測試中心完成。

1.2.3 載銅、載銀蒙脫石抑菌圈大小的測定 取無菌培養(yǎng)皿，分別加入約20 mL固體培養(yǎng)基，凝固作為底層，另取冷卻至50℃左右的半固體培養(yǎng)基5 mL，加入0.2 mL含菌量約106cfu/mL菌懸液，迅速搖勻倒在底層平板上，并晃動平板，使其鋪滿，作為菌層。稍干后用直徑5 mm的打孔器打孔，將4種載銅、載銀蒙脫石加于孔中，以滿而不溢為宜，并作好標記。于37℃培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈大小。

1.2.4 最小抑菌濃度的測定 采用常量肉湯稀釋法，取無菌試管13支，排成一排，除第1管加入2 mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基外，其余每管加入1 mL培養(yǎng)基，在第1管加入樣品0.256 g，混勻，然后吸取1 mL至第2管，混勻后再吸取1 mL至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第11管，并從第11管中吸取1 mL棄去，第12管為不含藥物的生長對照。此時各管藥物濃度依次為 256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg/mL。然后在上述每管內加入制備好的含1×106～2×106cfu/mL指示菌各1 mL，使每管最終菌液濃度約為5×105cfu/mL。第1管至第 11 管藥物濃度分別為 128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL（田文瑩等，2009）。

將接種好的無菌試管塞好塞子，置30℃普通空氣孵箱中孵育24 h。以肉眼觀察，藥物最低濃離心后的上清都移入容量瓶，洗滌4次后，定溶，測定容量瓶中Cu2+的濃度，計算樣品的吸附量和利用率；載銀試驗條件為：60℃水浴，反應時間3 h，固液比 1∶20，AgNO3濃度 0.03 mol/L，3000 r/min，離心10 min，其他步驟同上（夏枚生等，2006）。試驗采用離子選擇電極法測定Cu2+、Ag+濃度，計算吸附量（Q）采用公式：度管無細菌生長者，即為MIC。讀取和報告所測試菌株的MIC前，應檢查生長對照管的細菌生長情況是否良好，同時還應檢查接種物的傳代培養(yǎng)情況以確定其是否污染，質控菌株的MIC值是否處于質控范圍。

1.2.5 最小殺菌濃度的測定 從制備的4種載銅、載銀蒙脫石濃度高于MIC（包括MIC）的各瓶中吸取1 mL于平板上，霉菌于28℃培養(yǎng)72 h，酵母于28℃培養(yǎng)48 h，細菌于37℃培養(yǎng)24 h后，觀察結果，無菌生長的最低添加量為MBC。

2 結果

2.1 載銅、載銀蒙脫石中銅、銀含量 蒙脫石載銅、載銀后銅、銀含量見表1。

表1 載銅、載銀蒙脫石中Cu2+、Ag+含量

蒙脫石加載Cu2+、Ag+前后通過XRD測定的礦物成分及含量見表2，載銅、載銀蒙脫石含有蒙脫石中沒有的碳酸銀，氧化銀和孔雀石（堿式碳酸銅）。

表2 不同樣品的礦物成分及含量 %

2.2 載銅、載銀蒙脫石X射線衍射 載銅、載銀蒙脫石XRD圖譜和原蒙脫石XRD圖譜的對照見圖1、圖2，XRD圖譜無明顯差別。原蒙脫石M1的d（001）值為 14.985 ?，加載Cu2+、Ag+后的蒙脫石 M1的 d（001）值分別為14.341 ? 和 15.280 ?。 原蒙脫石M2的 d（001）值為 12.801 ?，加載 Cu2+、Ag+后的蒙脫石 M2的 d（001）值分別為 14.251 ? 和 14.985 ?。

2.3 載銅、載銀蒙脫石的抑菌圈 由表3可知，Ag+-M1、Ag+-M2抑菌圈直徑均在13.0 mm左右。抑菌圈越大，抗菌性能越好。由此可見，加載銀離子的蒙脫石具有更好的抑菌性能。

圖1 Cu2+-M1、Ag+-M1、M1 的 XRD 圖譜

圖2 Cu2+-M2、Ag+-M2、M2 的 XRD 圖譜

表3 載銅、載銀蒙脫石的抑菌圈直徑mm

2.4 載銅、載銀蒙脫石的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度 載銅、載銀蒙脫石對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC和MBC的影響，結果見表4和表5。

表4 載銅、載銀蒙脫石的MICmg/mL

表5 載銅、載銀蒙脫石的MBC

Ag+-M1對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC為0.125 mg/mL和0.25 mg/mL；Ag+-M2對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均為0.125 mg/mL。Ag+-M2對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MBC最低，分別為0.125 mg/mL和0.25 mg/mL。因此，載銀蒙脫石抗菌性能優(yōu)于載銅蒙脫石。

3 討論

3.1 載銅、載銀前后蒙脫石XRD的表征 蒙脫石的層內四次配位和六次配位的原子發(fā)生替代而產生負電荷，通過層間可交換陽離子來補償。蒙脫石特殊的層間結構，在加水后能發(fā)生膨脹，對陽離子具有很強的吸附力和交換能力。陽離子的價態(tài)與半徑均與蒙脫石的層間距有關系。蒙脫石層間距通常由XRD分析獲得的蒙脫石面網(wǎng)間距d（001）值確定。由載銅、載銀蒙脫石XRD圖譜和蒙脫石XRD圖譜（圖 1、圖 2）對比可見，原蒙脫石 M1的 d（001）值為14.985 ?，近似為鈣基蒙脫石。原蒙脫石 M2的 d（001）值為 12.801 ?，為鈉基蒙脫石（苗春省，1984）。 原蒙脫石 M1加載 Cu2+后 d（001）值變小，則搭載 Cu2+以后蒙脫石的層間距減小。在吸附Cu2+的蒙脫石及其熱處理產物的EPR研究中發(fā)現(xiàn)，水合銅離子進人層間后，并不是穩(wěn)定地滯留在蒙脫石的層間，有相當一部分Cu2+進入到Si-O四面體片中的復三方形孔洞中，也有部分Cu2+進入了八面體片中，這與Cu2+有較小的離子半徑關系密切 （Stadler和Schindler，1993），可能是搭載Cu2+以后蒙脫石的層間距減小的原因。Cu2+離子半徑為0.073 nm，與Al3+離子半徑0.072 nm非常相近，Cu2+進入八面體片后，對其晶體穩(wěn)定性沒有很大的影響。大部分八面體陽離子仍保持原位置未變，故并沒有改變其原有的晶體結構（何宏平和郭九皋，1999）。因此，蒙脫石在加載銅離子、銀離子后仍保持很好的吸附性能，以保證發(fā)揮較好的抗菌性能。 原蒙脫石 M2加載 Cu2+后 d（001）值變小，則搭載Cu2+以后蒙脫石的層間距增大，這可能是因為大部分交換的Cu2+以水和離子形式存在層間。原蒙脫石M1、M2加載 Ag+后 d（001）值都變大，則搭載 Ag+以后蒙脫石的層間距增大。由于鈣的離子半徑（0.1 nm）和鈉的離子半徑 （0.092 nm）比銀的離子半徑（0.126 nm）小，所以當銀離子通過離子交換的方式進入層間后，會使得層間距增大（余煥煥等，2013）。

蒙脫石加載銅離子、銀離子前后通過XRD測定的礦物成分及含量，載銅、載銀蒙脫石含有蒙脫石原礦中沒有的碳酸銀，氧化銀和孔雀石（堿式碳酸銅），說明Cu2+、Ag+加載到蒙脫石后存在氧化現(xiàn)象。銀離子無論是在見光、受熱等條件下都極易還原成金屬銀。銀離子還能與水介質中的多種陰離子反應，形成不溶于水的AgCl等。因此，實際應用中，應保證適宜的載銀量以降低原料成本和防止無機抗菌材料的氧化變色，制備的礦物抗菌劑應盡快密封保存，盡量避免Cu2+、Ag+被氧化而影響殺菌效果。

3.2 載銅、載銀蒙脫石抗菌機理與抗菌效果 天然礦物抗菌劑的作用機理有以下幾種假說：有觀點認為，蒙脫石加載Cu2+、Ag+，與指示菌接觸后，由于Cu2+、Ag+的還原性較強，離子交換所吸附的離子逐漸從層間域中溶出，而和細菌的細胞膜結合在一起，并穿透細胞壁，通過和細菌中的蛋白質和核酸反應，阻礙細菌的生物合成和能量傳遞，引起細菌酶蛋白變性和細胞膜生物學性質的破壞和損傷，使細菌失活，從而達到較好的殺菌效果 （Alvarez-Puebla等，2004）。也有一種觀點認為，載銅蒙脫石具有較好的殺菌活性是因為，搭載銅離子后的蒙脫石表面電荷發(fā)生變化，增強了蒙脫石與細菌的靜電吸附作用。另外，還有一種解釋認為，銀離子具有催化氧化性能，能氧化空氣和水中的氧形成羥基自由基和活性氧離子，破壞微生物的繁殖能力，起到抑菌和殺菌作用。

余志偉等 （2003）殺菌試驗表明，膨潤土與Ag+、Cu2+、Zn2+三種金屬離子制得的抗菌材料，都具有很好的殺菌抑菌效果，對大腸桿菌的殺滅率為100%，是理想的抗菌材料，與本試驗的研究結果較相符。加載銀離子的抗菌劑的抗菌性能優(yōu)于加載銅離子的抗菌劑，這可能是由于抗菌劑的抑菌性能與加載的金屬離子相關。Cu2+由于化學活性弱于Ag+，故其抑菌效果稍差。馬玉龍和郭彤（2007）有關載銅蒙脫石及其殺滅大腸桿菌機制的研究中得出結論為載銅蒙脫石對大腸桿菌的MIC和MBC分別為0.16 mg/mL和0.64 mg/mL。本試驗的結果與其存在一定差距，可能原因是蒙脫石原礦間存在的差異以及銀離子的吸附條件導致的吸附量不同，而影響其抗菌性能。王寧等（2000）有關非金屬礦物在抗菌材料中的應用的研究中表明，載銀蒙脫石對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的的MIC分別為125 mg/L和250 mg/L，本試驗的結果與其結論基本一致。

4 結論

載銅、載銀后的蒙脫石層間距發(fā)生變化，其優(yōu)異的吸附性和膠體性能依然存在。載銅、載銀蒙脫石對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有較強的抗菌性能，載銀蒙脫石的抗菌效果優(yōu)于載銅蒙脫石。

[1]國家食品藥品監(jiān)督管理局.YY/T 0577-2005[S].營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基.北京：中國標準出版社，2005-12-07.

[2]韓躍新，印萬忠，王澤紅，等.礦物材料[M].北京：科學出版社，2006.443～445.

[3]何宏平，郭九皋.蒙脫石等粘土礦物對重金屬離子吸附選擇性的實驗研究[J].礦物學報，1999，19（2）：231 ～ 235.

[4]胡秀榮，呂光烈，陳林深，等.天然蒙脫石與細菌相互作用機理的研究[J].藥學學報，2002，37（9）：718 ～ 720.

[5]馬玉龍，郭彤.載銅蒙脫石及其殺滅大腸桿菌機制的研究[J].藥學學報，2007，42（3）：318 ～ 322.

[6]孟艷麗.凹凸棒石、蒙脫石及其復合物對斷奶仔豬腸道的保護作用研究：[碩士學位論文][D].北京：中國農業(yè)科學院，2011.

[7]苗春省.X射線衍射快速劃分膨潤土類型的方法[J].礦物學報，1984，1：88～91.

[8]田文瑩，邱芳萍，劉洪霞，等.藥食同源真菌糞鬼傘不同提取物的活性研究[J].中國食用菌，2009，28（5）：37 ～ 39.

[9]王寧，李惠文，馮俊明，等.非金屬礦物在抗菌材料中的應用[J].高校地質學報，2000，2（6）：307 ～ 309.

[10]王修啟，戴文滔，陳寶妮，等.不同水平納米蒙脫石對斷奶仔豬生產性能的影響[J].糧食與飼料工業(yè)，2008，1：36 ～ 37.

[11]夏枚生，胡彩虹，趙文艷.載銅蒙脫石的抗菌機理研究[J].微生物學報，2006，46（3）：432 ～ 435.

[12]謝仲權，張軍民.天然礦物飼料添加劑[M].北京：中國農業(yè)出版社，2009.213.

[13]余煥煥，劉 芳，王士琦，等.載銀蒙脫石的制備及其對對硝基苯酚還原反應的催化性能[J].硅酸鹽學報，2013，41（11）：1581 ～ 1587.

[14] 余志偉，王筱明，王霞.蒙脫石抗菌材料研究[J].礦物巖石，2003，23（4）：15～17.

[15]Alvarez-Puebla R A，Aisa C，Blasco J，et al.Copper heterogeneous nucleation on a palygorskitic clay：an XRD，EXAFS and molecular modeling study[J].Applied Clay Science，2004，25：103 ～ l10.

[16]Stadler M，Schindler P W.Modeling ofH+and Cu2+adsorption on calcium-montmorillonite[J].Clays and clay Minerals，1993，41：288 ～ 296.■