秦順義， 黃寶霞， 秦建華， 王宏祥， 王 昕， 張建斌， 崔 君

（1.天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津西青 300384；2.河北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，河北保定 071001）

硒是人和動物所必需的微量元素，具有多種重要的生物學功能，缺硒可導致動物生產(chǎn)性能、繁殖性能和免疫功能降低 （Weeks等，2012；Chen，2012），因此補硒已成為畜牧業(yè)生產(chǎn)中的常規(guī)措施。由于亞硒酸鈉等無機硒源吸收率較低，毒性較高，且易對環(huán)境造成污染，故其應(yīng)用受到諸多限制。富硒酵母因具有硒含量高、成本低、生物利用率高、毒性小、對環(huán)境污染小等優(yōu)點，已成為最有可能替代亞硒酸鈉的有機硒源（Alimohamady等，2013；王宏祥等，2013）。本試驗研究富硒酵母對小鼠血漿白細胞介素2（IL-2）水平、空斑形成細胞溶血能力及腸道菌群的影響，以期為富硒酵母的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及主要儀器 富硒酵母：由南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院畜禽營養(yǎng)代謝病研究室研制，硒含量為500 mg/kg，其中有機硒含量在90%以上。小牛血清 （中國醫(yī)學科學院血液學研究所）；綿羊紅細胞（SRBC）和經(jīng)綿羊紅細胞吸收過的豚鼠血清補體 （江蘇省農(nóng)科院）；IL-2測定試劑盒 （解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所）。FMJ-182放射免疫γ-計數(shù)器 （上海原子核研究所）；721型可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；亞硒酸鈉（SS，分析純，天津市化學試劑研究所）。

1.2 試驗設(shè)計 昆明系清潔級小鼠60只，雌雄各半，體重18～22 g，經(jīng)3 d的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機平均分為3組（雌雄各半）：對照組、亞硒酸鈉組和富硒酵母組。對照組每日灌胃0.5 mL蒸餾水，亞硒酸鈉組和富硒酵母組每日分別灌胃亞硒酸鈉（2 μg Se/mL）和富硒酵母（2 μg Se/mL）各 0.5 mL。小鼠自由采食（普通配合飼料）、飲水，飼養(yǎng)過程中，每天換水，隔日換墊料。整個試驗期為28 d。

1.3 測定指標及方法 于試驗第11天，每組隨機選擇8只小鼠（雌雄各半），每鼠腹腔注射SRBC 0.2 mL進行致敏。

1.3.1 血漿中IL-2含量的測定 于試驗第15天，從致敏小鼠眼眶取血，分離血漿。血漿IL-2含量用放射免疫法在FMJ-182放射免疫γ-計數(shù)器上測定。IL-2放射免疫試劑盒由解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所提供，嚴格按照說明書進行操作。

1.3.2 脾臟空斑形成細胞溶血能力測定 于試驗第15天，取致敏小鼠脾臟制成勻漿，用pH 7.4的磷酸緩沖液（PBS）洗滌兩次，制成細胞懸液（5×106個/mL），按徐叔云等（2002）的分光光度法測定空斑形成細胞溶血能力：取細胞懸液0.5 mL，加入0.2%的SRBC和10%經(jīng)SRBC吸收過的豚鼠血清補體各0.5 mL，混勻；另設(shè)不加補體的作為空白；置于37℃的水浴鍋中，保溫1 h，3000 r/min離心5 min，取上清于413 nm處空白調(diào)零測吸光值。

1.3.3 腸道菌群的分析 試驗結(jié)束后，分別用SP、EMB、EC、BLB 和 LBS培養(yǎng)基培養(yǎng)葡萄球菌、大腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌及乳桿菌。以無菌方法取小鼠盲結(jié)腸內(nèi)容物0.1～0.2 g，置已稱重的帶玻珠的滅菌小管中，再次稱重，計算出小鼠腸內(nèi)容物重量。按 1∶10（W/V）加入適量稀釋液（滅菌的0.05%酵母粉生理鹽水溶液），然后將小管置于振蕩器上充分振蕩10 min，使其均質(zhì)化后，再依次進行10倍系列稀釋至10-9，然后取100 μL加入到各種培養(yǎng)基上，涂布均勻，每種培養(yǎng)基每個稀釋度涂布3個平板。接種完畢，分別將其進行需氧和厭氧培養(yǎng)，37℃，24 h（需氧培養(yǎng)）或 72 h（厭氧培養(yǎng)）后觀察結(jié)果。根據(jù)菌落特點、染色鏡檢，計算各平板上的菌落數(shù)，并計算出每克糞便中該菌的數(shù)量，結(jié)果以每克腸道內(nèi)容物中的菌落數(shù)的對數(shù)表示（lg cfu/g）。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計方法 數(shù)據(jù)均以 “平均數(shù)±標準差”表示，采用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用方差分析進行差異顯著性檢驗，如方差分析有顯著性差異，再進行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 富硒酵母對小鼠血漿中IL-2含量和空斑形成細胞溶血能力的影響 由表1可知，富硒酵母組、亞硒酸鈉組小鼠血漿IL-2含量和空班形成細胞溶血能力的OD413較對照組分別提高18.24%（P＜ 0.01）、17.65%（P ＜ 0.05）和 12.82%（P ＜ 0.01）、7.69%（P＜0.05）；富硒酵母組小鼠血漿IL-2含量和空班形成細胞溶血能力的OD413較亞硒酸鈉組分別提高0.50%和4.76%（P＞0.05）。

表1 富硒酵母對小鼠空斑形成細胞溶血能力和血漿IL-2含量的影響（n=8）

2.2 富硒酵母對小鼠腸道菌群的影響 從表2可知，富硒酵母組、亞硒酸鈉組和對照組小鼠腸道中葡萄球菌、腸球菌、腸桿菌、乳桿菌和雙歧桿菌數(shù)量均無顯著差異（P＞0.05）。

表2 富硒酵母對小鼠腸道菌群的影響lg cfu/g

3 討論

3.1 富硒酵母對小鼠空斑形成細胞溶血能力的影響 空斑形成細胞溶血能力是衡量機體體液免疫功能的重要指標?？瞻咝纬杉毎苎芰υ綇?，說明機體的體液免疫功能越強。杜瑩等（2006）研究結(jié)果也表明富硒蛋白能夠促進小鼠溶血空斑的形成。葉洪平和陳超（2010）也證實富硒綠茶可明顯促進小鼠溶血空斑的形成。本試驗結(jié)果表明，在外來抗原綿羊紅細胞作用下，富硒酵母和亞硒酸鈉均可顯著提高小鼠脾空斑形成細胞溶血能力，但二者作用效果無顯著差異。這說明補硒可有效增強機體的體液免疫功能。

3.2 富硒酵母對小鼠血漿中IL-2水平的影響抗原活化的T淋巴細胞分泌的IL-2細胞因子，不僅是T淋巴細胞的生長和活化因子，而且可促進B細胞、NK細胞、巨噬細胞等多種細胞的增殖和分化。在本試驗中，富硒酵母組和亞硒酸鈉組小鼠血漿IL-2均顯著高于對照組，且富硒酵母組和亞硒酸鈉組小鼠血漿IL-2含量無顯著差異。由此表明，富硒酵母可促進淋巴細胞分泌IL-2，進而增強小鼠的細胞免疫功能，但其作用效果與亞硒酸鈉相比無顯著差異。這與秦順義等（2007）和高建忠等（2006）在羔羊和仔豬上的研究結(jié)果相一致。杜立芹等（2000）研究也證實，富硒酵母可使環(huán)磷酰胺造成的免疫低下小鼠血清IL-2水平顯著增高。在體外試驗中，He等（2004）和 Brown 等（1985）也報道了類似的研究結(jié)果。

3.3 富硒酵母對小鼠腸道菌群的影響 動物體內(nèi)腸道菌群主要包括專性厭氧菌、兼性厭氧菌和需氧菌。在正常狀態(tài)下，腸道菌群的組成、種類都是較為穩(wěn)定的，腸道菌群之間的平衡狀態(tài)在維持動物機體的正常功能以及抵抗外襲菌方面起著重要的作用（O'Hara和 Shanahan，2007）。 本試驗結(jié)果表明，富硒酵母對小鼠腸道中的葡萄球菌、腸球菌、腸桿菌、乳桿菌和雙歧桿菌數(shù)量無顯著影響，說明富硒酵母不能改變小鼠腸道菌群的構(gòu)成和數(shù)量。 陳生龍（2009）和 Mathew等（1998）的研究表明，活酵母或酵母培養(yǎng)物對斷奶仔豬腸道菌群的構(gòu)成無影響。周淑芹和孫文志（2004）研究結(jié)果表明酵母培養(yǎng)物可顯著減少肉仔雞盲腸中大腸桿菌的數(shù)量并可增加雙歧桿菌的數(shù)量。胡友軍等（2003）研究結(jié)果也證實活性酵母可顯著減少早期斷奶仔豬腸道菌群中大腸桿菌的數(shù)量，并可調(diào)節(jié)腸道微生物菌群平衡。以上研究結(jié)果的差異可能與酵母菌的種類以及試驗動物的種類有關(guān)。

4 小結(jié)

本試驗結(jié)果表明，富硒酵母可顯著提高小鼠血漿IL-2水平和空斑形成細胞溶血能力，而對小鼠腸道菌群無顯著影響。

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