李素芬，趙 燕，冀蘆沙

（1.聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東聊城 252000；2.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東聊城 252000）

葉是植物體的基本營(yíng)養(yǎng)器官之一，在植物的生命活動(dòng)中起著重要作用，研究植物葉的發(fā)生、發(fā)育的分子機(jī)理，是發(fā)育生物學(xué)的一個(gè)重要課題。葉片發(fā)育的階段大致可分為葉原基的起始和葉極性的建立。葉原基是在莖的頂端分生組織（shoot apical meristem，SAM）中形成的。葉極性的建立是葉發(fā)育的核心環(huán)節(jié)。ZILBERMAN等的新細(xì)胞決定理論認(rèn)為，葉邊緣鋸齒、葉卷曲是某些直接或間接影響細(xì)胞分裂或生長(zhǎng)分化的基因突變?cè)斐傻模?］。從葉形成的分子機(jī)制上看，SAM細(xì)胞及周邊細(xì)胞的發(fā)育形成葉原基，葉原基產(chǎn)生極性分化并從細(xì)胞分裂狀態(tài)轉(zhuǎn)入細(xì)胞生長(zhǎng)階段，平展、正常的葉片逐漸形成?？刂七@一發(fā)育進(jìn)程的一系列基因的突變及影響細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)分化的因素都有可能使葉發(fā)育異常，產(chǎn)生卷曲、鋸齒狀等異型葉片［1］。

近年來(lái)研究表明，AGO1基因在植物葉極性的分化方面具有重要的調(diào)節(jié)作用。通過(guò)對(duì)AGO1基因進(jìn)行突變研究，發(fā)現(xiàn)AGO1基因能通過(guò)靶向作用于TCP轉(zhuǎn)錄因子基因家族來(lái)調(diào)控植物葉形態(tài)建成［2］。AGO1基因在芽頂端組織、花器官和果實(shí)中表達(dá)，AGO1基因過(guò)表達(dá)突變體產(chǎn)生葉片卷曲、花發(fā)育異常、葉片偏上生長(zhǎng)、果實(shí)畸形等異常表型。西紅柿中，LA基因編碼一個(gè)包含AGO1基因的轉(zhuǎn)錄因子，AGO1基因通過(guò)介導(dǎo)LA基因調(diào)控葉邊緣細(xì)胞發(fā)育。LA表達(dá)水平升高，導(dǎo)致葉邊緣發(fā)育異?；唤档蚅A表達(dá)水平，則使葉邊緣細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)。

AGO蛋白參與RISC復(fù)合體的形成，選擇性的招募microRNAs和siRNAs參與RNA沉默，是PTGS中RISC的催化發(fā)動(dòng)機(jī)。另外，AGO蛋白的一個(gè)很重要的功能是催化RISC對(duì)靶RNA的特異性切割。有研究表明，這個(gè)切割作用是由PIWI這個(gè)結(jié)構(gòu)域來(lái)完成的。PIWI與RNase H具有相似的結(jié)構(gòu)特征［3］，可以發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性以切割靶RNA。除了提供催化RISC切割活性外，PIWI結(jié)構(gòu)域中還存在一個(gè)可以直接與Dicer結(jié)合的區(qū)域，AGO蛋白可能就是以此為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)通過(guò)與Dicer互作而進(jìn)入RISC裝配過(guò)程的［4］。此外，AGO是構(gòu)成RdDM復(fù)合物重要成分，在異染色質(zhì)的沉默及傳播中是必需的。

在擬南芥中，AGO家族有10位成員，其中AGO1調(diào)節(jié)葉片發(fā)育，參與PTGS，可能是各種RNA剪切途徑剪切器的組分，是擬南芥中唯一參加miRNA生物途徑的AGO蛋白，AGO1在體外可以結(jié)合miRNA并催化靶基因的剪切［2］；AGO4參與轉(zhuǎn)座子和反向重復(fù)序列的DNA甲基化［5］，是維持異染色質(zhì)的必需因子，而且AGO4可以催化產(chǎn)生次級(jí)siRNA（secondary siRNAs）以放大沉默信號(hào)［6］；AGO6主要招募與異染色質(zhì)有關(guān)的siRNAs，在DNA甲基化和TGS途徑中起重要作用［7］；AGO7（又稱(chēng)ZIPPY）主要調(diào)節(jié)植物發(fā)育時(shí)速，是某些ta-siRNAs沉默復(fù)合體的形成所必需的［8-9］。

本實(shí)驗(yàn)以野生型擬南芥為背景克隆出編碼AGO1蛋白的基因［8］。構(gòu)建基因獲得AGO1植物表達(dá)載體pBI121-AGO1，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化擬南芥，通過(guò)抗性篩選，獲得轉(zhuǎn)基因植株。并通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型觀察及AGO1蛋白的RT-PCR檢測(cè)，以確定擬南芥中AGO1的功能。本實(shí)驗(yàn)為后續(xù)AGO1基因在擬南芥中功能的鑒定提供了有利的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 擬南芥來(lái)源

擬南芥（Arabidopsisthaliana）栽培品種Columbia。

1.1.2 質(zhì)粒與菌株

E.coliDH5α，BL21，克隆載體pGEM18-T Simple，由 Takara公司提供；P.pastorisGS115，pPIC9，pPIC9K，pF41，均由Clontech公司提供。

1.1.3 酶與試劑

限制性?xún)?nèi)切酶（NotⅠ，SalⅠ），T4DNA ligase，RNase A，IPTG，X-Gal，DNA Marker DL 2000，TagDNA聚合酶，DNA凝膠回收試劑盒（PCR Fragment Recovery Kit），質(zhì)粒微量提取試劑盒，RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0，均購(gòu)自寶生物（大連）公司。Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司。其他試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

參照Trizol說(shuō)明書(shū)從生長(zhǎng)4周大的野生型擬南芥中提取總RNA，將RNA溶于20μL含DEPC水中。按照RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒取2μL總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得10μL cDNA［9］。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)TAIR網(wǎng)站中AGO1基因編碼區(qū)序列以及酵母表達(dá)載體pPIC9K上的多克隆位點(diǎn)，通過(guò)Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)3對(duì)引物 P1：5′—ATGCCGGTTCAGTAGGAGGAGTCGC—3′；P2：5′—CATAAGCTCGACATTGCTTCCACCAACC—3′；P1GUS：5′—CGCATGATTGAACAAGATG—3′；P2GUS：5′—TCCCGCTCAGAAGAACTCGTC—3′。

1.2.3 質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建

將AGO1基因的PCR回收產(chǎn)物和pET30空載體以EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，37℃水浴過(guò)夜后，進(jìn)行瓊脂糖（質(zhì)量濃度10g／L）凝膠電泳并回收，然后在T4DNA連接酶作用下室溫連接4h，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，通過(guò)氨芐青霉素（Amp＋）抗性篩選得到AGO1基因的重組子。挑取陽(yáng)性克隆小提質(zhì)粒DNA并雙酶切鑒定。運(yùn)用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切重組質(zhì)粒，將AGO1基因片段連入雙元表達(dá)載體pBI121（35S：：GUS），與GUS融合蛋白，然后在T4DNA連接酶作用下室溫連接4h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過(guò)卡那霉素（Kan＋）抗性篩選得到重組子。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥篩選

鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌株GV3101，涂布于Kan＋抗性的LB平板37℃過(guò)夜培養(yǎng)。PCR鑒定陽(yáng)性克隆。然后挑取陽(yáng)性單克隆于2mL LB中，37℃230r／min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日5 000g離心5min，去上清收集菌體，加入5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的蔗糖溶液重懸。運(yùn)用浸花法侵染野生型擬南芥，在含50μg／mL（質(zhì)量濃度）卡那霉素的MS培養(yǎng)基上篩選T1代，取T1代和野生型植株的葉片提取DNA，以野生型為陰性對(duì)照進(jìn)行PCR鑒定，選取陽(yáng)性株系。取陽(yáng)性植株的T1代種子為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥拷貝數(shù)檢測(cè)

選用T1代葉片邊緣為鋸齒狀穩(wěn)定表型的5個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中各15棵擬南芥為遺傳材料，采用CTAB法提取T1代擬南芥基因組DNA。事先選取已證明為單拷貝純合體的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株基因組DNA樣品為對(duì)照，分別設(shè)計(jì)特異引物單獨(dú)擴(kuò)增內(nèi)源基因（α-tubilin）和外源基因（NPTⅡ），結(jié)果顯示內(nèi)源基因和外源基因具有相似的擴(kuò)增效率。因α-tubilin特異性引物，上游引物：5′-AGAAGAGCCTTTGCTGGCC-3′（P1），下游引物：5′-CCAACAATCTATCAGCCACG-3′（P2），目的片段大小為791bp；同時(shí)設(shè)計(jì)了外源基因NPTⅡ（新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ基因）的特異性引物，上游引物：5′-ACAATCGGCTGCTCTGATG-3′（P1），下游引物：5′-TCAGAAGAACTCGTCA AGAAG-3′（P2），目的片段大小為741bp。對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)最佳循環(huán)數(shù)確定在20～25之間［10］。因此本實(shí)驗(yàn)中，以擬南芥核基因組上單拷貝內(nèi)源基因?yàn)閮?nèi)參，與核基因組上插入的外源基因一起以提取的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株基因組DNA為模板，置于單一PCR管中同時(shí)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。PCR最佳反應(yīng)體系：94℃，3min，1個(gè)循環(huán)；94℃30s，56℃30s，72℃1min，24個(gè)循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下呈現(xiàn)出外源基因和內(nèi)源基因兩條目的片段大小不同的條帶，照相保存。將圖片置于ImageJ軟件下，捕捉分析兩條目的條帶的灰度比。同時(shí)該實(shí)驗(yàn)在相同條件下重復(fù)3次。

圖1 擬南芥AGO1基因全長(zhǎng)序列的克隆及測(cè)序Fig.1 Cloning and sequencing of the full-length Arabidopsis AGO1 gene

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥AGO1基因的克隆及鑒定分析

本實(shí)驗(yàn)以擬南芥野生型Columbia品種葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，使用Pfx高保真聚合酶，能夠很好的擴(kuò)增AGO1基因的相關(guān)序列。由于擬南芥基因組已知，根據(jù)TAIR網(wǎng)站上發(fā)布的AGO1基因序列設(shè)計(jì)5′端特異引物特異擴(kuò)增AGO1基因5′端，經(jīng)生工測(cè)序得該片段長(zhǎng)853bp（見(jiàn)圖1a）），且測(cè)序結(jié)果檢測(cè)顯示該片段包含AGO1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)ATG。隨即在基因的ORF去設(shè)計(jì)3′RACE引物對(duì)AGO1基因3′進(jìn)行擴(kuò)增，得到所示長(zhǎng)度為2 156bp（見(jiàn)圖1b））的AGO1基因序列，最終得到3 009bp的全長(zhǎng)（見(jiàn)圖1c））。對(duì)獲得的克隆進(jìn)行了全長(zhǎng)的測(cè)序（生工測(cè)序），得到了無(wú)突變的克隆，通 過(guò) 與 NCBI／TAIR 網(wǎng) 站 注 冊(cè) 的AGO1基 因（At1g48410）進(jìn)行比對(duì)，兩者的同源性高達(dá)96%（比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖1）。證實(shí)本實(shí)驗(yàn)克隆的基因?yàn)閿M南芥AGO1基因。AGO1全長(zhǎng)cDNA基因使用了在PCR產(chǎn)物3′端添加A堿基后，做T-A克隆的辦法，將基因的全長(zhǎng)cDNA序列克隆至pGEM T-easy克隆載體中，對(duì)連接后的載體進(jìn)行酶切驗(yàn)證（見(jiàn)圖1d））。

2.2 重組表達(dá)載體pBI121-AGO1的構(gòu)建

35S啟動(dòng)子在單子葉和雙子葉植物中可以高效啟動(dòng)外源插入片段的組成型表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)用XbaⅠ，BamHⅠ雙酶切將外源AGO1基因插入到植物高效表達(dá)載體pBI121的35S啟動(dòng)子與GUSA報(bào)告基因之間，得到如圖2a）所示的AGO1基因的高效表達(dá)載體，使AGO1-GUS融合蛋白在植物體內(nèi)得以高效表達(dá)。圖2b）為XbaⅠ和SalⅠ酶切鑒定結(jié)果。該載體含有卡那霉素（Kanamycin）抗性基因，轉(zhuǎn)化擬南芥以后可以用卡那霉素篩選農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體（GV3101-AGO1）。農(nóng)桿菌浸染植株后，該pBI121載體上左右邊界序列（LB及RB）之間的T-DNA區(qū)段將隨機(jī)整合入外植體基因組中，進(jìn)而得以轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

圖2 重組表達(dá)載體pBI121-AGO1的構(gòu)建Fig.2 Recombination of the pBI121-AGO1 vector

2.3 農(nóng)桿菌侵染后抗性轉(zhuǎn)基因植株的篩選情況及RT-PCR分析

侵染后的擬南芥植株成熟以后收獲的T1代種子，經(jīng)過(guò)消毒，播種在GM抗性培養(yǎng)基上（含 Kanamycin質(zhì)量濃度50mg／mL），4 ℃春化后放在長(zhǎng)日照條件下進(jìn)行萌發(fā)，篩選出抗性植株共34棵。將其進(jìn)行基因組PCR檢測(cè)GUSA基因，共篩選到pBI121-AGO1植株15棵。圖3為34棵T1代卡那抗性株系中對(duì)GUSA基因片段（750bp）進(jìn)行擴(kuò)增后篩選出的15棵AGO1轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因擬南芥在抗性培養(yǎng)基上萌發(fā)6～8d后將抗性苗移至營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中生長(zhǎng)。圖4a）所示為2周及4周后轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長(zhǎng)情況。如圖4b）所示為相應(yīng)的擬南芥RT-PCR分析AGO1的表達(dá)情況，Tubulin基因表達(dá)情況以及提取的總RNA作對(duì)照。

圖3 轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR鑒定Fig.3 PCR Amplification of the transgenic Arabidopsis

2.4 T1代轉(zhuǎn)基因植株表型觀察

把T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥在抗性培養(yǎng)基上萌發(fā)6～8d后將抗性苗移至營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中生長(zhǎng)4周，以觀察地上部分表型（如圖5）。與野生型相比，在15個(gè)轉(zhuǎn)AGO1基因的株系中有5個(gè)株系擬南芥出現(xiàn)明顯葉片細(xì)長(zhǎng)，呈鋸齒狀。

2.5 T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的拷貝數(shù)檢測(cè)

為了鑒定攜帶單拷貝外源基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，以擬南芥核基因組上已知的單拷貝內(nèi)源基因（αtubulin）為內(nèi)參，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株基因組DNA為模板，在同一PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增內(nèi)源基（α-tubulin）和外源目的基因（NPTⅡ），循環(huán)數(shù)為22，反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，獲得了預(yù)期大小的2條特異性擴(kuò)增條帶（見(jiàn)圖6）。從以上5個(gè)株系中選取10株轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，經(jīng)ImageJ軟件捕捉分析兩條目的條帶的灰度比，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)除1號(hào)轉(zhuǎn)基因株系外，其他轉(zhuǎn)基因株系中外源基因與內(nèi)源基因的擴(kuò)增條帶灰度比均為1，及初步說(shuō)明檢測(cè)植株即為單拷貝外源基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。1號(hào)轉(zhuǎn)基因擬南芥的灰度比為1.8，有待孟德?tīng)栠z傳實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 討 論

圖4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型及RT-PCR分析Fig.4 Phenotype and RT-PCR analysis of the transgenic Arabidopsis

3.1 克隆全長(zhǎng)基因的過(guò)程中需要注意的問(wèn)題

1）保證PCR模板的質(zhì)量 這就要求從RNA的提取開(kāi)始，每一步都要保證質(zhì)量，只有獲得高質(zhì)量的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，才能保證能夠擴(kuò)增出目的基因。

2）選擇合適的DNA聚合酶和合適的PCR反應(yīng)條件 一種合適的PCR聚合酶，既要有較高的酶活力，又要有較高的保真度。經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)摸索，筆者選擇了Invitrogen公司的Pfx高保真DNA聚合酶，該酶的保真度較高，同時(shí)酶活力也足以滿(mǎn)足擴(kuò)增3kb基因的需要。PCR反應(yīng)條件也是一個(gè)很重要的方面，主要的因素有退火溫度、延伸時(shí)間、擴(kuò)增循環(huán)數(shù)等，這些都需要經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)來(lái)獲得最優(yōu)化的方案。

3）選擇合適的RACE引物擴(kuò)增基因全長(zhǎng)常規(guī)意義上運(yùn)用RT-PCR技術(shù)克隆全長(zhǎng)基因，首先擴(kuò)增的是基因的中間片段，其次是設(shè)計(jì)特有的5′端和3′端的特異引物對(duì)基因的全長(zhǎng)進(jìn)行有效克隆。由于擬南芥基因組中AGO1基因序列已知，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)之初在AGO1基因5′端設(shè)計(jì)特異引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，獲得853bp中間片段。根據(jù)所得到的中間片段，設(shè)計(jì)引物3′-RACE嵌套式引物。同樣摸索引物組合及退火溫度。最后實(shí)驗(yàn)得到用5′引物和B26引物做第1次PCR，退火溫度選擇較低的50℃；PCR產(chǎn)物稀釋1 000倍后作為模板，以5′引物和B25為引物進(jìn)行第2次PCR，退火溫度提高到54℃。測(cè)序結(jié)果得到目的條帶。

圖5 葉片為鋸齒狀的T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥照片F(xiàn)ig.5 T1transgenic Arabidopsis with the serration margin leaves

圖6 單拷貝外源基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥鑒定Fig.6 Identification of transgenic plants carrying a single copy of integrated T-DNA

4）確定最佳的連接反應(yīng)和酶切反應(yīng)的時(shí)間 有文獻(xiàn)報(bào)道，連接反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間為48h，筆者的結(jié)果顯示，連接12h已經(jīng)足夠，過(guò)長(zhǎng)的時(shí)間毫無(wú)必要，反而延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)的周期。若酶切反應(yīng)不完全，或酶切后末端有復(fù)性會(huì)造成載體自身環(huán)化，平板上長(zhǎng)出大量陰性菌落，降低了連接效率，給挑去陽(yáng)性菌落帶來(lái)很大困難，因此應(yīng)盡量延長(zhǎng)酶切時(shí)間，保證酶切徹底，酶切反應(yīng)的時(shí)間至少1.5h。

3.2 轉(zhuǎn)基因方法的選擇

植物表達(dá)載體構(gòu)建好后，下一步即為基因轉(zhuǎn)化工作。將目的基因?qū)氚兄参锛?xì)胞內(nèi)，使其整合到植物基因組，使目的基因成為轉(zhuǎn)基因植物基因組的有機(jī)組成部分，并進(jìn)行可遺傳的表達(dá)。目前，基因轉(zhuǎn)化的方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和DNA直接轉(zhuǎn)化法。DNA直接轉(zhuǎn)化法包括：PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化法、基因槍法、電激法等。

與DNA直接轉(zhuǎn)化法相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具備很多明顯的優(yōu)點(diǎn)。在轉(zhuǎn)化質(zhì)量方面，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的DNA結(jié)構(gòu)完整、整合位點(diǎn)較穩(wěn)定、拷貝數(shù)低、轉(zhuǎn)化的片段較大（可達(dá)50kb）、轉(zhuǎn)化機(jī)理清楚、整合后的外源基因結(jié)構(gòu)變化較?。?］。而DNA直接轉(zhuǎn)化法，DNA結(jié)構(gòu)變化較大，會(huì)發(fā)生DNA甲基化、環(huán)化，片段分離和丟失、重排等，此外轉(zhuǎn)入基因拷貝數(shù)高，由此而引起的甲基化會(huì)造成基因表達(dá)沉默。在轉(zhuǎn)化效率方面，DNA直接轉(zhuǎn)化法效率比較低，為0.01%～1%，而農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的轉(zhuǎn)化效率約為0.1%～5%，甚至更高。此外，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法與DNA直接轉(zhuǎn)化法相比，在轉(zhuǎn)化和篩選上有簡(jiǎn)易性［10］。

當(dāng)然，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化也存在一些缺點(diǎn)，比如農(nóng)桿菌感染過(guò)程會(huì)對(duì)植物組織造成損傷，T-DNA整合如植物基因組時(shí)邊界可能會(huì)發(fā)生截短；T-DNA可能以串聯(lián)形式整合；甲基化等原因造成基因轉(zhuǎn)化后失活；轉(zhuǎn)移到T-DNA區(qū)的2個(gè)基因未必共表達(dá)等。但是瑕不掩瑜，隨著研究工作的深入，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法很可能會(huì)廣泛應(yīng)用于植物基因的轉(zhuǎn)化。

基于以上分析，筆者選擇了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，轉(zhuǎn)化擬南芥植株。

3.3 影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雙子葉植物基因轉(zhuǎn)化效率的因素

1）啟動(dòng)子 設(shè)計(jì)植物轉(zhuǎn)化方案所要考慮的一個(gè)非常重要的因素是啟動(dòng)子的選擇。本實(shí)驗(yàn)中筆者選用的是CaMV35S啟動(dòng)子，這種啟動(dòng)子在所有組織中都啟動(dòng)基因表達(dá)，具有持續(xù)性，不表現(xiàn)時(shí)間和空間的特異性；相對(duì)恒定的表達(dá)RNA和蛋白質(zhì)。

2）植物基因型 不同雙子葉植物對(duì)農(nóng)桿菌的敏感程度不同，甚至同一種雙子葉植物的不同品種對(duì)農(nóng)桿菌的敏感程度也會(huì)大不相同。Columbia型擬南芥對(duì)農(nóng)桿菌較敏感，轉(zhuǎn)化效率較高。

3）篩選用抗生素 篩選時(shí)所用的不同抗生素對(duì)于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞會(huì)有不同的傷害作用，從而使轉(zhuǎn)化效率受到影響。在篩選方案中應(yīng)選用對(duì)敏感細(xì)胞傷害大而對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞傷害小的抗生素作為篩選劑，既要保證較高的篩選效率又要保證較高的轉(zhuǎn)化效率。本實(shí)驗(yàn)所采用的表達(dá)載體含有卡那霉素（Kanamycin）抗性基因，因此轉(zhuǎn)化以后可以用卡那霉素作為農(nóng)桿菌的篩選劑。

4）農(nóng)桿菌菌株類(lèi)型 不同菌株對(duì)同一種植物的感染能力不同。本實(shí)驗(yàn)采用的根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）GV3101已被初步證明感染后的擬南芥能力較強(qiáng)。

5）表面活性劑的選擇 轉(zhuǎn)換用的表面活性劑Silwet L-77能促進(jìn)農(nóng)桿菌吸附于外植體表面，促進(jìn)TDNA的轉(zhuǎn)移，在最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%時(shí)可以使侵染效率提高到4倍［8］。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

通過(guò)提取總RNA進(jìn)行RT-PCR，及PCR方法成功克隆了AGO1基因。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)花序浸泡法成功獲得了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。RT-PCR分析轉(zhuǎn)基因植株顯示，轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)2周時(shí)AGO1蛋白的表達(dá)量明顯多于非AGO1基因轉(zhuǎn)基因植株，在第4周時(shí)對(duì)照轉(zhuǎn)基因植株與AGO1基因轉(zhuǎn)基因植株中AGO1蛋白的表達(dá)量基本相當(dāng)，但比野生型植株表達(dá)量多。從獲得的T1代超表達(dá)AGO1基因轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型可以看出，超表達(dá)AGO1基因轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片明顯成鋸齒狀，說(shuō)明AGO1基因?qū)M南芥葉片發(fā)育有影響［11-12］。超表達(dá)AGO1基因轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片的鋸齒狀表型與已報(bào)道的擬南芥AGO1基因突變體表型相近，至于產(chǎn)生這一表型的原因仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。在15個(gè)轉(zhuǎn)AGO1基因的株系中僅有5個(gè)株系擬南芥出現(xiàn)明顯葉片細(xì)長(zhǎng)，呈鋸齒狀。對(duì)以上5個(gè)轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)除1號(hào)株系以外其他4個(gè)株系均為單拷貝插入，從實(shí)驗(yàn)水平上證實(shí)，轉(zhuǎn)基因株系葉片鋸齒狀表型并不是由于多拷貝數(shù)的外源基因在轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程中的基因沉默而引起的。表型觀察發(fā)現(xiàn)1號(hào)轉(zhuǎn)基因株系葉片鋸齒狀程度明顯低于其他4個(gè)株系。此外，本次實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谝詫?shí)驗(yàn)所得的轉(zhuǎn)有AGO1基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥為實(shí)驗(yàn)材料，僅以分析AGO1在植物發(fā)育，響應(yīng)外源脅迫及相關(guān)途徑中的作用。為進(jìn)一步分析miRNA作用機(jī)理及RNAi介導(dǎo)的作用通路提供材料支撐。

AGO1基因是小RNA功能途徑中一個(gè)關(guān)鍵的基因，目前對(duì)于AGO1基因功能的研究已經(jīng)取得了一些成果。以往的研究多是基于遺傳學(xué)手段，從突變體入手，從表型來(lái)鑒定基因的功能。使用這一辦法確實(shí)取得了一些成果［13-14］。但是，隨著研究的深入，問(wèn)題逐漸暴露出來(lái)：首先，在大多數(shù)物種中，AGO1基因家族都是有多個(gè)成員組成的，這些成員之間勢(shì)必存在著功能上的冗余，這就為遺傳學(xué)研究帶來(lái)了很大的困難，以擬南芥為例，在擬南芥目前已經(jīng)鑒定的10個(gè)AGO1基因中僅有AGO1，AGO4，AGO7等基因有了明確的功能研究［15］，其余的功能至今未知；其次，小RNA發(fā)揮功能過(guò)程，不僅僅是幾個(gè)基因的作用，還有很多基因參與其中，這其中就有一些是我們還未知的［4］；最后，小RNA的行使功能的過(guò)程，并不僅僅是蛋白組分發(fā)揮作用，其中還有小RNA本身。基于上述原因，建議從生物化學(xué)的角度出發(fā)，結(jié)合分子生物學(xué)手段來(lái)解決這些問(wèn)題。

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