周福波，李 強，強慧妮，崔婷婷，郭 森，楊鈺琪，李春英，高天文

白癜風是一種常見的色素脫失性疾病，病因復雜。黑素細胞的殺傷、脫失是白癜風發(fā)病的效應環(huán)節(jié)，而CD8+T淋巴細胞對黑素細胞的殺傷作用已在多項研究中得到證實[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)，在白癜風發(fā)病中，細胞毒性T淋巴細胞特異性識別的自身抗原主要來源于tyrosinase，gp100，Melan A/MART-1 等[3,4]。在對高加索人的研究中已經(jīng)確定的白癜風抗原表位主要有以下幾條HLA-A*0201限制性的短肽：tyrosinase369-377，3D、gp100 209-217，2M、gp100 280-288，9V、Melan A/MART-1 26-35，2L 以及 Melan A/MART-1 26-35[5,6]。但高加索人、印度人、中國漢族人等不同人種的主要組織相容性復合體（MHC）分子易感基因位點可能存在明顯差異[7]。本研究的目的是對漢族進展期白癜風患者針對上述已知表位肽段的細胞免疫應答情況進行研究，明確其在漢族人白癜風發(fā)病中所起的作用，并通過對治療前后免疫應答水平的比較，進一步明確與病情的活動和轉(zhuǎn)歸有無關(guān)聯(lián)。

1 對象和方法

1.1 研究對象

102例研究對象均為我科門診就診的進展期白癜風患者，符合白癜風診斷標準[8]，病程在3個月內(nèi)且病情快速進展，色素脫失范圍大于體表面積5%，2個月內(nèi)未行任何治療。其中男45例，女57例，年齡6～54歲，平均年齡（27.6±10.7）歲，病程20～87 d，平均46 d。所有患者抽取10 ml全血進行檢測，HLA-A*0201患者治療1個月、3個月后復診時再次抽血檢測。

1.2 抗原表位肽段的合成

根據(jù)先前文獻中已經(jīng)報道的肽段[1,3-6]，由上海生物工程技術(shù)服務有限公司合成以下HLA*0201限制性短肽：tyrosinase369-377，3D ：YMDGTMSQV，gp100 209-217，2M: IMDQVPFSV，gp100 280-288，9V：YLEPGPVTV，MART-1 26-35，2L：ELAGIGILTV，MART-1 26-35：EAAGIGILTV，陽性對照肽段 flu 58-66：GILGFVFTL，以及無關(guān)肽段HIV p17Gag：SLYNTVATL。

1.3 方法

1.3.1 外周血單個核細胞（PBMC）分離 利用Ficoll密度梯度離心法進行外周血PBMC分離：將10 ml外周血與10 ml PBS混勻后逐滴滴入10 ml淋巴細胞分離液中，2 000 r/min離心20 min。吸出白膜層，用PBS稀釋，混勻，1 000 r/min離心10 min。倒去上清，再次洗滌，細胞沉淀即為外周血PBMC。

1.3.2 DNA提取 利用北京TIANGEN基因組DNA提取試劑盒對所有患者提取外周血DNA后送至深圳華大臨床檢驗中心有限公司基因行HLA-A位點分型檢測。

1.3.3 ELISPOT實驗 γ-干擾素 (IFN-γ) ELISPOT試劑盒購自瑞典MABTECH AB公司。無菌PBS清洗孔板后每孔加入200 l易得培養(yǎng)基室溫封閉30 min。去除培養(yǎng)基，每孔加入2×105個PBMC，依次加入上述白癜風相關(guān)肽段(終濃度為10 g/ml)，同時設置陽性刺激孔(CD3 1:1 000) 、無關(guān)對照孔(HIV p17Gag SLYNTVATL)，每個患者設置3組重復。37℃，5%CO2恒溫孵箱孵育36 h后棄細胞懸液，無菌PBS清洗5次。將7-B6-ALP鏈霉親和素按照1:200稀釋于含0.5%胎牛血清的PBS后每孔添加100 l室溫孵育2 h。清洗孔板，每孔添加100 l BCIP/NBT底物液后常溫避光放置，孔板顯清晰斑點后即沖洗。晾干后利用讀板儀計數(shù)斑點數(shù)。每2×105個PBMC中斑點形成細胞數(shù)目（SFC）為：孔內(nèi)斑點數(shù)-同一患者無關(guān)肽段孔的斑點數(shù)。每孔的斑點形成細胞數(shù)目即為2×105個PBMC中可以特異性識別肽段的T細胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad Prism 5軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析及制圖。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HLA-A位點分型

HLA-A為等位基因，102例進展期白癜風患者HLA-A位點分型結(jié)果及不同HLA-A位點限制性患者數(shù)見表1。 HLA-A*0201限制性患者占總例數(shù)的38.24%（39/102），非HLA-A*0201限制性患者占61.76%（63/102）。

表1 102例進展期白癜風患者HLA-A位點分型

2.2 ELISPOT實驗結(jié)果

HLA-A*0201限制性患者與非HLA-A*0201限制性患者ELISPOT結(jié)果見圖1。與非HLA-A*0201限制性患者相比，HLA-A*0201限制性患者對白癜風表位肽段、流感病毒肽段有較強的反應。

2.3 2例HLA-A*0201患者治療前后細胞免疫水平

選取2例患者行窄譜中波紫外線（NB-UVB）照射、局部外用鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（他克莫司）治療后明顯緩解的HLA-A*0201患者追蹤其細胞免疫應答變化，結(jié)果見表2。

第27號患者經(jīng)過1個月的治療后，針對2號、5號肽段的細胞免疫水平有所上升，而針對其他肽段的細胞免疫水平下降。經(jīng)過3個月的治療后，針對所有肽段的細胞免疫應答水平均有所下降。

圖1 不同HLA-A分型的白癜風患者ELISPOT實驗結(jié)果

第43號患者在經(jīng)過1個月、3個月的治療后，針對每一條白癜風相關(guān)肽段的細胞免疫應答水平均有所下降。

表2 2例HLA-A*0201患者治療后細胞免疫水平變化

3 討論

白癜風患者發(fā)病時自身反應性T淋巴細胞對黑素細胞的破壞已在多項研究中得到證實。而作為自身免疫反應的始動環(huán)節(jié)——自身抗原的識別，一直是白癜風自身免疫機制研究的熱點。從1998年開始，相繼有研究證實，在白癜風的發(fā)病中，患者的外周血PBMC可以特異性識別黑素細胞分化抗原，主要為tyrosinase、gp100、Melan A/MART-1[3-6,9]。但由于在不同的研究中患者人種、地區(qū)、疾病進展情況、HLA-A位點的不同，其得出的結(jié)論不完全一致。尤其是tyrosinase、Melan A/MART-1，對于其是否能夠在白癜風發(fā)病中發(fā)揮自身抗原作用，目前結(jié)論尚不一致[3,5]。

近年來的高通量基因組學研究——GWAS研究證實，白癜風發(fā)病中同一分子的易感位點在不同的人群中存在著一定程度的差異。Birlea等[10]發(fā)現(xiàn)在高加索人群中，白癜風易感的基因位點主要位于MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ類分子上。而漢族人的白癜風易感位點與之不同[11]?？紤]到不同的MHC分子對抗原肽的提呈不同，且目前尚不明確在高加索人白癜風患者的抗原表位肽段是否也為漢族白癜風人群的抗原表位。我們選取進展期白癜風患者進行細胞免疫應答的研究，以便更加客觀地反映白癜風患者急性發(fā)病時的細胞免疫狀況。

HLA分型方面，HLA-A*0201限制性患者所占比例最大（38.24%），其次為HLA-A*1101、HLA-A*2402、HLA-A*3001、HLA-A*0301、HLA-A*0206等，這與之前在漢族人群中進行的HLA-A易感位點分析是一致的[12,13]。通過利用5條不同的肽段刺激白癜風患者外周血PBMC，我們發(fā)現(xiàn)HLA-A*0201限制性患者對這5條肽段有著較高的應答反應，而非HLA-A*0201限制性的患者則對這些肽段反應較弱。說明已知的高加索人白癜風自身抗原肽段也能夠被漢族易感人群的免疫細胞特異性識別，進而在白癜風的發(fā)病中發(fā)揮作用。而2例患者針對gp100 280-288，9V肽段特異性反應水平最高，這說明白癜風患者針對gp100有著較強的免疫反應，這與之前相關(guān)報道結(jié)果一致[3]。對2例患者治療前后不同時間段細胞免疫水平進行比較，我們發(fā)現(xiàn)患者針對不同肽段的細胞免疫應答水平隨著病情的好轉(zhuǎn)有所下降，提示患者的病情變化與細胞免疫應答水平存在著一定程度的關(guān)聯(lián)。有研究對18例進展期白癜風與6例穩(wěn)定期白癜風患者細胞免疫功能進行比較，發(fā)現(xiàn)患者PBMC僅對gp100的識別在兩組之間有所差異，進而得出僅gp100肽段的反應與疾病進展程度相關(guān)[3]。鑒于我們僅觀察了2例患者治療前后的變化，尚需要對更多患者的細胞免疫狀況進行比較，方能得出更加客觀的結(jié)論。

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