陸東和　蘇華堂　陳祖鉛　黃輝煌

摘要：以自主篩選的乳酸菌L17、微球菌W1和葡萄球菌P8為菌種，進(jìn)行發(fā)酵培根加工。研究培養(yǎng)條件及三菌不同接種量組合對(duì)微生物發(fā)酵培根品質(zhì)的影響規(guī)律，并對(duì)微生物發(fā)酵培根和亞硝酸鈉發(fā)色培根的亞硝酸鈉殘留量、酸價(jià)、過(guò)氧化值等理化指標(biāo)進(jìn)行比較。研究結(jié)果表明30℃，24～27h為最佳培根微生物發(fā)酵條件；乳酸菌107cfu/g、微球菌106cfu/g和葡萄球菌106cfu/g為最優(yōu)接種組合；微生物發(fā)酵培根的亞硝酸鈉殘留量明顯低于亞硝酸鈉發(fā)色培根，但兩者的酸價(jià)和過(guò)氧化值無(wú)明顯差異。

關(guān)鍵詞：微生物 發(fā)酵 培根 發(fā)色 亞硝酸鈉

中圖分類號(hào)：TS251 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2014）16-0001-04

在培根加工中，亞硝酸鹽具有十分重要的作用。亞硝酸鹽不僅有助于培根特征性紅色的生成，還能促進(jìn)風(fēng)味形成，預(yù)防酸敗，并抑制有害微生物尤其是肉毒梭菌的繁殖和產(chǎn)毒，從而延長(zhǎng)肉制品的貨架期。但是，亞硝酸鹽能與多種氨基化合物反應(yīng)產(chǎn)生致癌的亞硝基化合物，如亞硝胺等[1]。因此，國(guó)際上對(duì)食品中亞硝酸鹽的安全問(wèn)題非常重視，一直在積極尋找安全可靠、經(jīng)濟(jì)適用、能替代亞硝酸鹽的肉制品加工技術(shù)。本研究以自主篩選的乳酸菌、微球菌和葡萄球菌作為發(fā)酵菌株，應(yīng)用于發(fā)酵培根制作；通過(guò)測(cè)定培根成品的色差、酸價(jià)、過(guò)氧過(guò)值等理化指標(biāo)及感官指標(biāo)的評(píng)定，確定了培根微生物發(fā)酵的最佳微生物組合及其接種量，發(fā)酵條件等工藝參數(shù)。本研究可以為培根制作中采用微生物發(fā)酵技術(shù)替代亞硝酸鹽腌制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）供試菌株。自主篩選的乳酸菌L17、微球菌W1和葡萄球菌P8。

（2）豬肉。購(gòu)于南昌雙匯食品有限公司。

（3）主要培養(yǎng)基。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，酵母提取物5g，MgSO4 0.58g，MnSO4 0.25g，K2HPO4 2g，檸檬酸二銨2g，乙酸鈉5g，吐溫80 1mL，蒸餾水1000mL；pH值6.2～6.4，12l℃滅菌20min；固體培養(yǎng)基添加1.5%-2.0%的瓊脂[2]。

增殖活化培養(yǎng)基：胰蛋白胨8.5g，月示胨11g，大豆胨1.5g，酵母浸膏3g，葡萄糖1.8g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀1.25g，蒸餾水1000mL；pH值7.0-7.4，121℃滅菌15min[3]。

PCA培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.0g，酵母浸膏2.5g，葡萄糖1.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1000mL，pH值7.0±0.2[4]。

（4）主要試劑。蛋白胨、酵母膏、牛肉膏，北京奧博星生物科技有限公司；硫酸銨、氯化鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉、葡萄糖，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、鹽酸，天津市博迪化工有限公司；硫酸銨、氯化鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸二胺，天津市恒星化學(xué)試劑制造有限公司；吐溫80，青島益維康生物科技有限公司；亞硝酸鈉，西隴化工股份有限公司。

（5）主要儀器設(shè)備。冷凍超速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；CR-400色差計(jì)，柯尼卡美能達(dá)傳感技術(shù)股份有限公司；722S可見分光光度計(jì)，上海奧譜勒儀器有限公司；PHS—25C數(shù)顯酸度計(jì)，上海宇隆電子儀器有限公司；XW—80A微型漩渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；HY—4型調(diào)速多用振蕩器，常州國(guó)華電器有限公司；DHP—9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；HQ45Z型恒溫?fù)u床，武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培根配方與工藝流程

（1）培根配方。

以1kg豬肉計(jì)：豬肉肥瘦比為3：7，食鹽20g，味精5g，白砂糖18g，磷酸鹽3.5g，水100g。

（2）工藝流程。

亞硝酸鹽發(fā)色培根：

原料肉→分割→配料→注射→滾揉→腌制→裝模→蒸煮→速凍→切片→成品

微生物發(fā)酵培根：

原料肉→分割→配料→接種、鹽水混合→注射→滾揉→發(fā)酵→裝?！糁蟆賰觥衅善?/p>

1.2.2 菌種活化

乳酸菌用MRS液體培養(yǎng)基活化，葡萄球菌和微球菌用增值活化培養(yǎng)基活化[5]。

1.2.3 乳酸菌種子液培養(yǎng)條件研究

（1）最佳培養(yǎng)時(shí)間。挑取一環(huán)活化的菌體，接種于裝有10mL種子培養(yǎng)基的試管，35℃搖床培養(yǎng)16h，然后取3mL菌液轉(zhuǎn)接于裝有75mL種子培養(yǎng)基的三角瓶（250ml）中，在35℃條件下?lián)u床培養(yǎng)，每隔2h取樣，測(cè)定其在660nm處的OD值，根據(jù)OD值確定菌株在種子培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線，確定種子最佳培養(yǎng)時(shí)間[6]。

（2）培養(yǎng)基裝載量。挑取一環(huán)活化的菌體，接種于裝有10mL種子培養(yǎng)基的試管，35℃搖床培養(yǎng)16h，然后以3%的接種量分別接種于裝有25ml、50mL、75mL、100mL、125mL、150mL的種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，在35℃條件下?lián)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)18h后取樣測(cè)定測(cè)定其在660nm處的OD值[7]。

1.2.4 種子液制備

挑取一環(huán)活化的菌體，接種于裝有10mL種子培養(yǎng)基的試管，35℃搖床培養(yǎng)16h，然后取3ml菌液轉(zhuǎn)接于裝有65mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在35℃條件下?lián)u床培養(yǎng)18小時(shí)，備用。

1.2.5 溫度對(duì)乳酸菌發(fā)酵培根呈色效果的影響

將制備好的種子液，按微生物發(fā)酵培根生產(chǎn)工藝以107cuf/g·肉的接種量進(jìn)行接種發(fā)酵，分別在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃條件下進(jìn)行發(fā)酵，每隔3小時(shí)進(jìn)行取樣，樣品經(jīng)72℃蒸煮30min，充分冷卻，速凍24小時(shí)后進(jìn)行切片、色差分析[8]。

1.2.6 乳酸菌發(fā)酵呈色與亞硝酸鈉發(fā)色比較

以15mg/kg、30mg/kg、45mg/kg、60mg/kg的亞硝酸鈉4℃發(fā)色27h的培根為對(duì)照，分別測(cè)定以105cfu/g·肉、106cfu/g·肉、107cfu/g·肉、108cfu/g·肉的接種量接種乳酸菌，30℃發(fā)酵27h，72℃蒸煮30min，充分冷卻，速凍24小時(shí)的培根色差值，進(jìn)行對(duì)比分析。

1.2.7 乳酸菌、微球菌和葡萄球復(fù)合發(fā)酵對(duì)培根品質(zhì)的影響

乳酸菌、微球菌和葡萄球菌最佳組合接種量。以培根產(chǎn)品感官評(píng)定得分為指標(biāo)，將乳酸菌、微球菌、葡萄球菌按表1的方案進(jìn)行組合接種正交試驗(yàn)，優(yōu)化發(fā)酵培根工藝中乳酸菌、微球菌、葡萄球菌的配比。

1.2.8 微生物發(fā)酵培根與亞硝酸鹽發(fā)色培根理化指標(biāo)比較

根據(jù)三菌組合接種正交試驗(yàn)結(jié)果，分別以乳酸菌、微球菌和葡萄球菌接種量107 cfu/g、106 cfu/g、106 cfu/g進(jìn)行三菌復(fù)合發(fā)酵培根制作（30℃，27h），以30 mg/kg·肉亞硝酸鈉發(fā)色培根（4℃，27h）為對(duì)照；測(cè)定不同發(fā)酵工藝培根的亞硝酸鹽殘留、酸價(jià)和過(guò)氧化值。

1.3 分析測(cè)定方法

菌體密度：采用分光光度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液在660nm處的OD值；色差分析：用色差計(jì)測(cè)定培根切片的L值（亮度）、a值（紅度）和b值（黃度）；亞硝酸鹽殘留：按GB/T 5009.33-2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》規(guī)定的方法測(cè)定[9]；酸價(jià)、過(guò)氧化值：按GB/T 5009.37-2003《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》規(guī)定的方法測(cè)定[10]；感官評(píng)定：將待檢樣品切片后，由10名具有食品專業(yè)背景人員組成感官評(píng)定小組，采用評(píng)分法，針對(duì)樣品的色澤、狀態(tài)、香氣、滋味進(jìn)行評(píng)價(jià)[11]，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)處理重復(fù)3次，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.0，計(jì)算不同品質(zhì)指標(biāo)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，應(yīng)用FishersLSD方法進(jìn)行多重比較，分析不同處理組間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌種子液培養(yǎng)條件研究

2.1.1 最佳培養(yǎng)時(shí)間

不同培養(yǎng)時(shí)間的種子液OD值如圖1所示。由圖1可知，在前期8h的培養(yǎng)期內(nèi)，種子液OD值隨培養(yǎng)時(shí)間變化不大。此時(shí)菌體處于延遲期，細(xì)胞正處于合成生長(zhǎng)繁殖所需物質(zhì)的階段。當(dāng)種子液培養(yǎng)至8～20h，樣品的OD值隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而迅速增加，此段時(shí)間菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體生長(zhǎng)旺盛，代謝活力比較高；此時(shí)接種不僅可以縮短菌種的延滯期，而且可以縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備的利用率；種子培養(yǎng)20h后，樣品的OD值隨培養(yǎng)時(shí)間變化趨于平緩，進(jìn)入穩(wěn)定期。所以，選擇18～20h為種子的最佳培養(yǎng)時(shí)間。

2.1.2 培養(yǎng)基最佳裝液量

不同裝液量對(duì)培養(yǎng)基OD值的影響見圖2。由圖2可知，在50～100ml/250ml的裝液量范圍內(nèi)其OD值變化不大，裝液量過(guò)少或過(guò)多均將影響種子液的效果；當(dāng)裝液量超過(guò)100ml，由于溶氧不足及有害氣體不易排出等原因[12]，導(dǎo)致菌體代謝被抑制，生長(zhǎng)緩慢，使其OD值將急劇下降。因此，以50-75ml/250ml的裝液量為最佳。

2.2 溫度對(duì)乳酸菌發(fā)酵培根呈色效果的影響

在對(duì)發(fā)酵培根的色澤評(píng)價(jià)中，因?yàn)辄S色（b值）會(huì)對(duì)紅色（a值）造成很大的影響，因此單純測(cè)定產(chǎn)品的紅度值（a值）并不能完全反映感官觀察結(jié)果[13]。不同溫度條件下乳酸菌發(fā)酵對(duì)培根樣品色差L值、a值、b值的影響規(guī)律見圖3。從圖3可以看出，色澤總的變化趨勢(shì)是：在15-35℃溫度范圍內(nèi)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵培根的亮度值（L值）和紅度值（a值）逐漸上升，黃度值（b值）在發(fā)酵和成熟過(guò)程中不斷下降。在40℃時(shí)隨著發(fā)酵時(shí)間的變化，發(fā)酵培根的明度值（L值）、紅度值（a值）和黃度值（b值）均呈現(xiàn)不規(guī)則的變化，表明在40℃下發(fā)酵的培根質(zhì)量不穩(wěn)定。在30℃或35℃時(shí)經(jīng)24-27h發(fā)酵后的培根色澤最好，而隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)色澤變化不明顯（圖3）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在35℃發(fā)酵的培根比在30℃發(fā)酵的培根的感官與風(fēng)味差。因此，確定30℃為微生物發(fā)酵培根的最適發(fā)酵溫度，且發(fā)酵時(shí)間為24-27小時(shí)。

2.3 乳酸菌發(fā)酵呈色與亞硝酸鈉發(fā)色比較

乳酸菌發(fā)酵與亞硝酸鈉發(fā)色對(duì)培根色差a值的影響見表3。由表3可知隨著乳酸菌接種量提高，培根的a值（紅度）也逐漸提高；當(dāng)乳酸菌的接種量超過(guò)107cfu/g·肉時(shí)，接種量對(duì)發(fā)酵培根的a值（紅度）貢獻(xiàn)逐漸降低。當(dāng)乳酸菌的接種量為108cfu/g·肉時(shí)，其a值為13.33；該值與當(dāng)亞硝酸鈉用量為30mg/kg·肉時(shí)的培根a值較為接近。表明選取該乳酸菌以108cfu/g·肉的接種量進(jìn)行發(fā)酵培根呈色，經(jīng)30℃發(fā)酵27h后的培根呈色效果相當(dāng)于以30mg/kg·肉亞硝酸鈉添加量，經(jīng)4℃發(fā)色27h的培根。

2.4 乳酸菌、微球菌和葡萄球菌復(fù)合發(fā)酵及最佳組合接種量確定

三菌復(fù)合發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知：當(dāng)乳酸菌接種量從106cfu/g增加到107cfu/g，感官得分從73.3分增加到80.23分，當(dāng)乳酸菌接種量從107cfu/g增加到108cfu/g，感官得分從80.23分下降到79.63分，差異不明顯；當(dāng)微球菌接種量從105cfu/g增加到106cfu/g，感官得分從74.6分增加到79.33分，當(dāng)微球菌接種量從106cfu/g增加到107cfu/g，感官得分從79.33分下降到79.23分，無(wú)明顯差異；說(shuō)明當(dāng)微球菌接種量達(dá)到106 cfu/g時(shí)發(fā)酵效果較好，隨著接種量的增加對(duì)其感官品質(zhì)無(wú)顯著改善。當(dāng)葡萄球菌接種量從104cfu/g增加到105cfu/g，感官得分從74.27分增加到78.83分，當(dāng)葡萄球菌接種量從105cfu/g增加到106cfu/g，感官得分從 78.83分增加到80.07分，差異較為顯著；說(shuō)明葡萄球菌的接種量為104cfu/g～106cfu/g時(shí)，隨著接種量的增加，培根的感官品質(zhì)也逐漸提高。因此當(dāng)乳酸菌、微球菌和葡萄球菌接種量分別為107cfu/g、106cfu/g、106cfu/g時(shí)，微生物發(fā)酵培根的香味、口感、色澤等感官質(zhì)量最好。因此，發(fā)酵培根中乳酸菌、微球菌和葡萄球菌的最佳接種組合為：乳酸菌107cfu/g、微球菌106cfu/g和葡萄球菌106cfu/g。

2.5 微生物發(fā)酵培根與亞硝酸鹽發(fā)色培根理化指標(biāo)比較

2.5.1 亞硝酸鹽殘留

在肉制品腌制過(guò)程中，亞硝酸鹽具有十分重要的作用，它不僅有助于形成特征性的腌肉紅色，還能促進(jìn)產(chǎn)品風(fēng)味形成，抑制酸敗和有害微生物尤其是肉毒梭菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)毒，從而延長(zhǎng)肉制品的貨架期。但是，亞硝酸鹽能與多種氨基化合物反應(yīng)產(chǎn)生致癌的亞硝基化合物，如亞硝胺等[14]。因此，國(guó)際上對(duì)食品中亞硝酸鹽的安全問(wèn)題非常重視，一直在積極尋找安全可靠、經(jīng)濟(jì)適用、能替代亞硝酸鹽的肉制品發(fā)色劑。由圖4可知，微生物發(fā)酵培根亞硝酸鹽殘留量為1.93mg/g，遠(yuǎn)低于對(duì)照組的亞硝殘留量和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的上限30mg/g。

2.5.2 酸價(jià)

脂肪的腐敗主要有兩個(gè)途徑，一是水解途徑，另一個(gè)是氧化途徑；多數(shù)情況下兩種途徑同時(shí)存在。脂肪的水解，多數(shù)是在光、水、催化劑和微生物分泌脂肪酶的作用下，分解成游離的甘油、低級(jí)甘油酷和脂肪酸[15，16]。通常以酸價(jià)表示脂肪的水解程度，酸價(jià)越高，表明水解越嚴(yán)重。由圖5可知，微生物發(fā)酵培根的酸價(jià)低于對(duì)照組，兩者都低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的上限4.0mg/g。微生物發(fā)酵培根雖然經(jīng)過(guò)較高溫度發(fā)酵（30℃，27h），但酸價(jià)卻低于亞硝酸酸低溫腌制（4℃，27h）的培根，其原因可能在于發(fā)酵時(shí)間較短（27h），脂肪氧化作用微弱，酸價(jià)的變化主要以水解為主，而接種發(fā)酵能抑制其它微生物的生長(zhǎng)，從而抑制脂肪的水解。

2.5.3 過(guò)氧化值

動(dòng)物油脂中的不飽和脂肪酸氧化會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品酸敗。氧化反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò)氧化物越多，說(shuō)明脂肪的酸敗越嚴(yán)重。因此，通常以油脂過(guò)氧化值的大小表示油脂的腐敗變質(zhì)情況。由圖6可知，微生物發(fā)酵香腸的過(guò)氧化值略高于對(duì)照組，但差異不顯著，而且均低于國(guó)標(biāo)規(guī)定的上限0.50g/100g。這可能是由于發(fā)酵培根需在較高的溫度下進(jìn)行一段時(shí)間培養(yǎng)（30℃，27h），而亞硝酸鹽發(fā)色僅需在低溫（4℃）下進(jìn)行，較高的溫度會(huì)加速樣品中不胞和脂肪酸氧化所致。

3 結(jié)語(yǔ)

（1）在培根加工中，微生物發(fā)酵的最佳條件為發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間24～27h；乳酸菌、微球菌和葡萄球菌的最佳接種量組合為：乳酸菌107cfu/g、微球菌106cfu/g和葡萄球菌106cfu/g。

（2）經(jīng)30℃發(fā)酵27h的培根呈色效果相當(dāng)于添加30mg/kg·肉亞硝酸鈉經(jīng)4℃發(fā)色27h的培根；微生物發(fā)酵培根的亞硝酸鈉殘留量明顯低于亞硝酸鈉發(fā)色培根，但兩者的酸價(jià)和過(guò)氧化值無(wú)明顯差異。

（3）雖然微生物發(fā)酵對(duì)培根呈色，風(fēng)味形成有一定作用，而且對(duì)酸價(jià)、過(guò)氧化值的影響較?。坏⑸锇l(fā)酵對(duì)培根中有害微生物尤其是肉毒梭菌的繁殖和產(chǎn)毒的抑制作用還有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]尚麗娟.肉制品加工技術(shù)[M].中國(guó)輕工業(yè)出版社，2013.

[2]周德慶.微生物學(xué)教程[M].北京：高等教育出版社，2002.

[3]蔣云升，潘明，汪志君.火腿中葡萄球菌的分離篩選及其生物學(xué)特性的研究[J].食品科學(xué)，2007，2，8（1）：13-15.

[4]GB/T 4789.2-2008.食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)，菌落總數(shù)測(cè)定[S].

[5]Salim Ammor，Eric Dufour，Monique Zagorec，et al.Characterization and selection of Lactobacillus sakei strains isolated from traditional dry sausage for their potential use as starter cultures[J].Food Microbiology，2005（22）：529-538.

[6]張娜，郭元昕，Tadayuki Imanaka，王澤建，郭美錦，儲(chǔ)炬.一株乳酸菌的鑒定、生物學(xué)特性與發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究[J].食品工業(yè)，2012（12）：78-80.

[7]楊曉暉，籍保平，李博，等.泡菜中優(yōu)良乳酸菌的分離鑒定及其發(fā)酵性能的研究[J].食品科學(xué)，2005，26（5）：130-134.

[8]Millar S J，Moss B W，Stevenson M H.Some observation on the absorption spectra of various myoglobin derivatives found in meat[J].Meat Science，1996，42：277-288.

[9]GB/T 5009.33-2003.食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定[S].

[10]GB/T 5009.33一2003.食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法[S].

[11]吳祖興.乳酸菌在發(fā)酵香腸中的應(yīng)用研究[J].食品工業(yè)科技，2002，23（8）：55-57.

[12]卜永士，郭本恒.一株干酪乳桿菌的生物學(xué)特性研究[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2004（02）.

[13]Afef Najjari， Hadda Ouzari，Abdellatif Boudaous，et al.Method for reliable isolation of Lactobacillus sakei strains originating from Tunisian seafood and meat products[J].International Journal of Food Microbiology，2008，121：342-351.

[14]李超，董明盛.一種改進(jìn)的產(chǎn)生物胺乳酸菌的檢測(cè)方法[J].食品科學(xué)，2005，26（6）：193-196.

[15]馬德功.發(fā)酵香腸中乳酸菌的分離、篩選及其運(yùn)用[D].濟(jì)南：山東輕工業(yè)學(xué)院，2008.

[16]Papamanoli El，Kotzekidou Pl.Characterization of micrococcaceaeisolated from dry fermented sausage[J].Food Microbiology，2002（19）：441-449.