付瓏

摘要：目的：對國標GB/T 5009.22-2003中第二法ELISA法測定花生油中黃曲霉毒素B1的樣品前處理進行改良。方法：通過分別考察不同濃度的甲醇提取溶劑，分液漏斗萃取的不同振蕩力度及頻率，pH的調(diào)節(jié)對免疫反應的影響等。結(jié)果：提出了樣品處理的最佳組合：使用60%甲醇提取液，分液漏斗萃取最優(yōu)轉(zhuǎn)速250rpm，振蕩時間15min，樣品提取物pH調(diào)節(jié)為6-8。新改進方法下樣品加標回收率在80～110%之間。提高了ELISA法檢測花生油黃曲霉毒素B1的效率和準確度。

關(guān)鍵詞：花生油 黃曲霉毒素B1 ELISA 前處理方法 改進

中圖分類號：R155.5+8 文獻標識碼：A 文章編號：1672-5336（2014）16-0025-02

Abstract：objective：The ELISA detection method of Aflatoxin B1 in peanut oil should be optimized in national standard（GB/T 5009.22--2003）.Method：Respectively inspect different concentration of methanol extraction solvent，and extract different oscillation intensity and frequency with separating funnel，as well as study the effect of pH adjustment on the immune response.Result：Abstract the best combination of sample processing by using 60% methanol extract，the optional way of separating funnel extraction speech is 250rpm，the oscillation time is 15min，pH adjustment of sample extracts is 6—8.The sample standard addition recovery rate is between 80% and 110% with the new improved method.It helps improve the ELISAs efficiency and accuracy of detecting Aflatoxin B1 in peanut oil.

Key Words：peanut oil；aflatoxin B1；ELISA；pretreatment method；improvement

黃曲霉毒素（Alfatoxin，AFT）主要是黃曲霉和寄生曲菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，具一類化學結(jié)構(gòu)類似的化合物，二氫呋喃香豆素的衍生物。主要包括B1、B2、G1、G2、M1、M2等六種成分[1]。是一種劇毒物質(zhì)。1993年被衛(wèi)生組織的癌癥研究機構(gòu)定為1類致癌物，其中以黃曲霉毒素B1最為多見，其毒性和致癌性也最強[2]。植物油中的黃曲霉毒素B1是食品中真菌毒素殘留的日常檢測指標[3]。我國規(guī)定AFB1在花生油的最大限量標準為20μg/kg。目前常見的方法主要有薄層層析法（TLC）、液相色譜法（HPLC）和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[4]。TLC和HPLC法存在樣品處理復雜，分析時間長，設(shè)備昂貴等缺點，ELISA法因靈敏、簡便、快速、成本低廉，適合大批量檢測而被廣泛應用。AFB1檢測的準確度與樣品是否完全提取有關(guān)。如何提高樣品的提取率，本文從樣品提取溶劑比例、萃取的振蕩力度及頻率、pH的控制等因素進行改進研究，減少人工操作，提高檢測的準確度。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

酶標儀（上海三科儀器有限公司）、分液漏斗振蕩器（日本ATAGO）、ELISH快速測試盒（山西德豐信成生物科技有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）、分析天平（德國SARTOIUS）、50～300μL八道移液器（Thermo Scientific）。甲醇（天津永大化學試劑有限公司）、石油醚（廣州化學試劑廠）均為分析純。

1.2 樣品采集

實驗用10批次花生油，購自市場糧油銷售點。

1.3 樣品提取

（1）國標方法。參照國標（GB/T 5009.22-2003）中第二法的樣品處理方法，制成樣品提取物。

（2）對國標方法加以改進。準確稱取5g花生油于25mL燒杯中，用20mL石油醚分次將試樣轉(zhuǎn)移至125mL分液漏斗中，準確加入25mL提取液，加塞，振搖10秒后排氣，再加塞，防止液漏，移到一定轉(zhuǎn)速的分液漏斗振蕩器振蕩一定時間，靜置分層，放出下層提取液，此液即為樣品提取物。

1.4 ELISA檢測步驟

（1）從冰箱中取出黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫試劑盒，平衡至室溫。把濃縮洗滌液按3：57比例稀釋，配成洗滌工作液，并清洗抗體板條2次，拍干后備用。

（2）選擇數(shù)孔分別加入50μL黃曲霉毒素B1系列標準溶液ng/mL（0、0.25、0.5、1、2.5），其余孔內(nèi)各加入 50μL待測樣品提取液，隨即在各孔分別加入50mLAFB1抗體和50μL酶結(jié)合物，搖勻，37℃避光溫育30min。將溫育后的抗體板取出，棄去未反應抗原溶液，用洗滌液洗滌4次。拍下后各孔分別加入100μL顯色劑。37℃顯色5min。往各孔中分別加入50μL終止液，立即用酶標儀在450nm波長處測定各孔OD值，并繪制標準曲線，計算出樣品中的AFB1含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 各種提取溶劑的配比比例對AFB1提取效果的影響

將5μg/kg、20μg/kg、50μg/kg三種濃度的AFB1標準品分別添加于花生油樣品中，采用上述表1的配比設(shè)計進行提取處理，按1.3.2、1.4試驗步驟，根據(jù)標準曲線測定AFB1的含量，每個濃度重復三次測定，同時做樣品空白。計算各個配比的加標回收率。

從表2中可以說明，對于不同污染程度的花生油樣品，各溶劑比例對回收率存在很大差異。對于低濃度的樣品（加標5μg/kg），50%甲醇水回收率較好；其他回收率超過100%，容易造成假陽性；對于中度污染樣品（加標20μg/kg），60%甲醇水回收率接近100%，比較理想；對于重度污染的樣品（加標50μg/kg），80%甲醇水回收率最高。由于花生油的國家標準限量要求為≤20μg/kg，所以FLASH作為大量樣品篩查的方法，采用甲醇/水（60：40）作為樣品提取溶劑效果最佳。

2.2 分液漏斗振蕩器轉(zhuǎn)速對結(jié)果的影響

花生油樣品處理固定振蕩時間為15min，研究振蕩速度對AFB1提取效果的影響，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，當轉(zhuǎn)速達到250rpm后，AFB1測定值達到穩(wěn)定，轉(zhuǎn)速增大，測定結(jié)果變化不大。所以本優(yōu)化方法選定分液漏斗振蕩器轉(zhuǎn)速為250rpm。

2.3 振蕩時間對結(jié)果的影響

花生油樣品處理固定振蕩器轉(zhuǎn)速為250rpm，研究振蕩時間對AFB1提取效果的影響，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，AFB1與振蕩時間成正比，當振蕩時間達到15min時，AFB1測定值達到最大值。所以本優(yōu)化方法選定振蕩時間為15min。

2.4 pH值對結(jié)果的影響

當pH<4時，A1/A0較低，結(jié)果呈假陽性；當pH>8時，結(jié)果呈陰性。由于60%甲醇提取液的pH值為4～6之間，故需要用NaoH溶液調(diào)節(jié)pH為6～8，使酶活性在正常范圍內(nèi)，再進行提取和測定。

2.5 優(yōu)化方法與國標方法（GB/T 5009.22-2003中第二法）的比較

選取10份花生油樣品，以5μg/kg濃度加標，通過兩種前處理方法，其回收率見表3。優(yōu)化方法的回收率比國標法高。優(yōu)化方法減少了人工操作，使用分液漏斗振蕩器固定了轉(zhuǎn)速，振蕩時間，避免人為因素帶來的誤差，而國標法處理步驟繁瑣，并且其凝結(jié)物不易完全溶解，粘附于蒸發(fā)皿上，降低回收率。因此，當前優(yōu)化的前處理方法具有較好的實際操作與參考意義。

3 結(jié)語

本文探討了ELISA法最佳提取黃曲霉毒素B1參數(shù)，分別考察了不同濃度的甲醇提取溶劑，分液漏斗萃取的不同振蕩力度及頻率，pH的調(diào)整對免疫反應的影響等。對國標GB/T 5009.22-2003中第二法ELISA測定花生油中黃曲霉毒素B1的樣品前處理進行改良，提出了樣品處理的最佳組合：使用60%甲醇提取液，分液漏斗萃取最優(yōu)轉(zhuǎn)速250rpm，振蕩時間15min，樣品提取物pH調(diào)節(jié)為6-8。本方法與國標比較，統(tǒng)一了操作者的振搖力度與頻率，減少了人為操作，避免人為因素帶來的誤差，縮短了前處理時間。新改進方法下樣品加標回收率在80～110%之間。本實驗的意義在于提高了ELISA法檢測花生油黃曲霉毒素B1的效率和準確度。

參考文獻

[1]陳淑潤.ELISA法檢測大米、食用油中黃曲霉毒素B1前處理方法的研究[J].福建輕紡，2006，7：30-33.

[2]蘭珊珊，劉宏程.梅文泉.楊芳，酶聯(lián)免疫法測定不同食用植物油中黃曲霉毒素B1[J].糧食與油脂， 2006，4：39-41.

[3]GB/T 5009.22-2003，食品中黃曲霉毒素B1的測定[S].

[4]陳曉玲，戴曉瑛，羅建平.酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測食用油中黃曲霉毒素B1[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2000，10（1）：59-60.