陳宇 王芳 李耀亭

摘要 [目的]研究不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度對(duì)斷血流愈傷組織的誘導(dǎo)效果。[方法]通過(guò)配制不同的培養(yǎng)基，選擇適宜誘導(dǎo)斷血流愈傷組織的培養(yǎng)基;然后選用適宜的培養(yǎng)基，研究不同濃度的6-BA及NAA對(duì)斷血流愈傷組織誘導(dǎo)的影響。[結(jié)果]MS、N6、B5、RM、Miller 5種基本培養(yǎng)基中，適合斷血流愈傷組織誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基為MS;研究不同的生長(zhǎng)素NAA及細(xì)胞分裂素6-BA濃度時(shí)發(fā)現(xiàn)，NAA為0.1 mg/L和6-BA為1.0 mg/L時(shí)，斷血流組培效果較好。[結(jié)論]斷血流組培效果最好的培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基中NAA為0.1 mg/L和6-BA為1.0 mg/L。

關(guān)鍵詞 斷血流;培養(yǎng)基;植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑;誘導(dǎo);愈傷組織

中圖分類(lèi)號(hào) S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）33-11667-02

Research on the Condition of Calls Induction of Genuine Clinopodii polycephali of Anhui

CHEN Yu1， WANG Fang1， LI Yao-ting2*

（1. Xishan Biotechnology Company Ltd of Luan， Luan， Anhui 237005; 2.Plant Cell Engineering of West Anhui University Engineering Research Center of Anhui， Luan， Anhui 237012）

Abstract [Objective] The research aimed to study the effect of the media types and the concentration of plant growth regulator on the callus induction of Clinopodii polycephali. [Method] Choose the suitable culture medium from the preparation of different kinds of medium. In the appropriate culture medium cases， the effect of the different concentration of 6-BA and NAA on inducing callus of Clinopodii polycephali were studied.[Result]MS was best to induce callus of Clinopodii polycephali among MS， N6， B5， RM， Miller.The research of the different concentrations of auxin NAA and cytokinin 6-BA found that when NAA was 0.1 mg/L and 6-BA was 1.0 mg/L， the effect on inducing callus of Clinopodii polycephali was better. [Conclusion]The best suitable medium was MS with NAA 0.1 mg/L and 6-BA 1.0 mg/L.

Key words Clinopodii polycephali;Medium; Plant growth regulator; Induction; Callus

基金項(xiàng)目 安徽省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（12010402083）。

作者簡(jiǎn)介 陳宇（1988- ），女，山東棗莊人，碩士，從事中藥材病蟲(chóng)害防治研究。*通訊作者，工程師，博士，從事中藥材組培及栽培技術(shù)研究。

收稿日期 2014-10-15

斷血流是1970年從安徽民間發(fā)掘出來(lái)的止血藥，為皖西大別山道地中藥，是唇形科植物風(fēng)輪菜Clinopodium chinensis或蔭風(fēng)輪Clinopodium polycephalum的干燥地上部分;風(fēng)輪菜載于1406年的《救荒本草》，蔭風(fēng)輪載于1848年的《植物明實(shí)圖考》。風(fēng)輪菜分布于浙江、江西、福建、廣東、廣西、貴州等地;蔭風(fēng)輪主要分布于江蘇、安徽、廣西、貴州、云南、四川等地。皖西大別山斷血流年產(chǎn)量300 t左右，藥材微苦、味澀、辛涼，其功能為涼血止血。2005版藥典一部收載的斷血流即為上述2種原植物。臨床上應(yīng)用于吐血、咯血、尿血、崩漏、外傷出血等[1-4]，用處較廣，市場(chǎng)潛力良好。筆者通過(guò)試驗(yàn)研究不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及添加的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度對(duì)斷血流愈傷組織的誘導(dǎo)效果，為進(jìn)一步的誘導(dǎo)育種和斷血流皂苷A的工業(yè)化生物合成奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

六安霍山采集的斷血流。

1.2 培養(yǎng)條件

在無(wú)菌室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度控制在（25±2）℃，光照強(qiáng)度 1 800～2 000 lx，每天光照 12 h。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同基本培養(yǎng)基對(duì)斷血流愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

1.3.1.1 培養(yǎng)基的配制。

以MS、N6、B5、RM、Miller為基本的培養(yǎng)基，附加蔗糖30 g/L、瓊脂4 g/L、細(xì)胞分裂素6-BA（1.0 mg/L）和生長(zhǎng)素NAA（0.1 mg/L）。將做好的培養(yǎng)基攪拌均勻，并用氫氧化鈉將pH調(diào)整至5.8～6.0。

1.3.1.2 培養(yǎng)基的滅菌。將配制好的培養(yǎng)基分裝到組培瓶中，用蓋子封好，分裝，封口、 標(biāo)明培養(yǎng)基種類(lèi)和日期，放入高壓滅菌鍋滅菌。

1.3.1.3 接種外植體。接種前，將斷血流幼嫩的莖尖先用洗衣粉水溶液浸泡5～10 min，再用自來(lái)水沖洗30 min。將試驗(yàn)要用到的解剖刀、剪刀、鑷子、培養(yǎng)皿等先放入超凈工作臺(tái)上，打開(kāi)紫外燈照射 20 min。20 min 后攜帶外植體進(jìn)入無(wú)菌室，用75%的乙醇擦拭超凈工作臺(tái)面、雙手及接種工具。金屬接種工具每次使用前均要在酒精燈上灼燒滅菌。先用 75%的乙醇對(duì)嫩葉進(jìn)行表面消毒，再用0.1% 的 HgCl2滅菌 5～8 min，用無(wú)菌水沖洗5次，在滅菌過(guò)程中要不斷搖晃試管，使其充分滅菌。如此重復(fù)進(jìn)行 3 次滅菌，將已滅菌的斷血流幼嫩的莖尖，在無(wú)菌條件下切成5 mm×5 mm大小的方塊。分別接種到5種培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基接種5瓶，每種培養(yǎng)基重復(fù)3次。

1.3.2 不同濃度的6-BA及NAA對(duì)斷血流愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

1.3.2.1 培養(yǎng)基的配制。

以MS為基本的培養(yǎng)基，附加蔗糖30 g/L、瓊脂4 g/L、細(xì)胞分裂素6-BA和生長(zhǎng)素NAA。將做好的培養(yǎng)基按照一定梯度加入激素?cái)嚢杈鶆颍ū?），并用氫氧化鈉將pH調(diào)整至5.8～6.0。分裝，封口、標(biāo)明濃度和日期。

1.3.2.2 培養(yǎng)基的滅菌。滅菌方法同“1.3.1.2”項(xiàng)的方法。

表1 以MS為基本培養(yǎng)基的不同激素濃度的培養(yǎng)基

1.3.2.3 接種外植體。

接種前的準(zhǔn)備工作同“1.3.1.3”項(xiàng)，在超凈工作臺(tái)上，每個(gè)濃度的培養(yǎng)基接種 5 瓶，每瓶接種5個(gè)嫩莖小塊，接種后標(biāo)明接種時(shí)間。每個(gè)濃度重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種基本培養(yǎng)基對(duì)斷血流愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從接種3周后不同基本培養(yǎng)基對(duì)斷血流愈傷組織誘導(dǎo)的影響（表2）可以看出，MS培養(yǎng)基中原球莖出現(xiàn)率顯著高于N6和B5培養(yǎng)基等，MS、N6、B5、RM培養(yǎng)基均能夠誘導(dǎo)斷血流原球莖外植體，但Miller基本培養(yǎng)基不能誘導(dǎo)斷血流外植體的出現(xiàn)。由此可見(jiàn)，適合斷血流愈傷組織誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基為MS。

表2 5種基本培養(yǎng)基對(duì)斷血流愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2 不同濃度的6-BA及NAA對(duì)斷血流愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從接種3周后不同濃度的6-BA及NAA對(duì)斷血流原球莖形成的結(jié)果（表3）可以看出，不同濃度的6-BA及NAA對(duì)斷血流形成原球莖的效果不同，培養(yǎng)基（1）和（2）上培養(yǎng)出的原球莖健壯度較好，且原球率的出現(xiàn)率較高，但比較而言培養(yǎng)基（1）誘導(dǎo)效果顯著好于培養(yǎng)基（2）;培養(yǎng)基（3）和（4）上培養(yǎng)出原球莖數(shù)量少，且健壯度差。

表3 6 種不同濃度培養(yǎng)基對(duì)斷血流愈傷組織誘導(dǎo)的影響

3 結(jié)論

斷血流的組織培養(yǎng)研究在我國(guó)目前沒(méi)有報(bào)道。該試驗(yàn)在總結(jié)前人研究成果[5-6]的基礎(chǔ)上，研究了不同基本培養(yǎng)基和不同濃度的激素對(duì)斷血流組培的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)基（1）即MS培養(yǎng)基中NAA 0.1 mg/L、6-BA 1.0 mg/L，在斷血流組培中作用最好。

該組培最好的培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織原球莖出現(xiàn)率為52%，較低，是生長(zhǎng)素濃度的影響還是其他因素的影響，還需要進(jìn)一步的研究。

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