姜暉

（恩宜琺瑪（天津）工程有限公司上海分公司，上海 200052）

透明質(zhì)酸的生產(chǎn)工藝是典型的生物發(fā)酵及提取過程。其中，生物發(fā)酵復(fù)雜多變，并且直接影響到產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，對于生產(chǎn)過程至關(guān)重要，本文將對其著重介紹。

1 透明質(zhì)酸

透明質(zhì)酸（bHA）具有良好的保濕作用，其多用于制藥及化妝品，它的特點是保濕性受周圍環(huán)境的相對濕度影響較小。透明質(zhì)酸在相對濕度較低時(33%)吸濕量相對最高，在相對濕度較高時(75%)吸濕量相對最低。這種獨特的性質(zhì)適合不同季節(jié)、不同環(huán)境濕度(如干燥的冬季和潮濕的夏季)皮膚對化妝品保濕作用的要求。

透明質(zhì)酸分子中含有大量的羧基和羥基，在水；溶液中形成分子內(nèi)和分子間的氫鍵，這使其具有強大的保水作用，可結(jié)合自身400倍以上的水；在較高濃度時，由于其分子間作用形成的復(fù)雜的三級網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其水溶液又具有顯著的粘彈性。透明質(zhì)酸作為細(xì)胞間基質(zhì)的主要成分，直接參與細(xì)胞內(nèi)外電解質(zhì)交流的調(diào)控，發(fā)揮物理和分子信息的過濾器作用。大分子透明質(zhì)酸對細(xì)胞移動、增殖、分化及吞噬功能有抑制作用，小分子透明質(zhì)酸則有促進作用。

透明質(zhì)酸可用作眼科人工晶體植入手術(shù)的粘彈劑、骨性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等關(guān)節(jié)手術(shù)的填充劑，作為媒介在滴眼液中廣泛應(yīng)用，還用于預(yù)防術(shù)后粘連和促進皮膚傷口的愈合。與其它藥物反應(yīng)形成的化合物對藥物發(fā)揮緩釋作用，可達到定向和定時釋放的目的。隨著醫(yī)藥科技的發(fā)展，透明質(zhì)酸在醫(yī)藥方面的應(yīng)用將越來越廣泛。

2 透明質(zhì)酸生產(chǎn)中的生物發(fā)酵

透明質(zhì)酸生產(chǎn)中生物發(fā)酵簡單的工藝流程見圖1:

圖1

2.1 混料

混料罐用于進行原材料的預(yù)混，預(yù)混好的料將用于種子發(fā)酵工序或者主發(fā)酵工序。混料罐是手動操作，原材料和溶液在混料罐中通過攪拌混勻以后通過泵轉(zhuǎn)移至下一級罐，而混料罐的在線清洗是通過在線清洗站自動控制來完成?；炝瞎薜娜莘e大小需根據(jù)產(chǎn)品產(chǎn)量來決定，混料的時間通常小于1h。

具體操作流程為：

1）將料斗安裝在罐口，另一端接到排風(fēng)系統(tǒng)以防止粉塵散落到房間中。2）打開手動操作閥門通過觀察稱重傳感器加入一定量的純水在混料罐中。3）將裝有原材料的袋子通過叫料斗倒入混料罐。4）pH值按工藝需要調(diào)節(jié)到4～10。5）當(dāng)原材料完全被倒入罐底以后，將攪拌器調(diào)整至高速。6）通過傳輸泵將混合好后的溶液轉(zhuǎn)移至種子發(fā)酵罐。7）混料罐溶液轉(zhuǎn)移完成以后需要通過在線清洗站做在線清洗，此時攪拌器轉(zhuǎn)速需要跳到低速，在線清洗可以將罐中殘留清洗干凈，以免對下一個批次產(chǎn)生污染及影響。

2.2 給料

給料罐用于準(zhǔn)備蔗糖溶液，而后蔗糖溶液被轉(zhuǎn)移至種子發(fā)酵罐或者主發(fā)酵罐。通常給料罐包含兩個給料罐和一條轉(zhuǎn)移管道，目的是為了操作可以在循環(huán)模式下進行，以確保每一個罐都能通過一個循環(huán)。當(dāng)一個罐里的蔗糖溶液用完以后，將會從轉(zhuǎn)移管道斷開，進行清洗、滅菌，再加入新的培養(yǎng)基溶液再次連接到轉(zhuǎn)移管道，從而形成一個循環(huán)。所有的操作均為手動操作，只有在線清洗為自動操作。

具體操作流程為：

1）通過手動閥門從轉(zhuǎn)移管道斷開給料罐，連接兩個給料罐通過特殊的截斷閥門，以保證不出現(xiàn)交叉污染。2）通過在線清洗站做在線清洗，此時攪拌器轉(zhuǎn)速需要跳到低速。在線清洗是為了確保罐里沒有上一批次溶液的殘留和污染。3）培養(yǎng)基準(zhǔn)備：安裝手動料斗在罐口，另一端接到排風(fēng)系統(tǒng)以防止粉塵散落到房間中。4）打開手動操作閥門通過觀察稱重傳感器加入一定量的純水在給料罐中。5）將裝有蔗糖的袋子通過叫料斗全部倒入給料罐中。6）給料罐通過蒸氣進行加熱。7）當(dāng)蔗糖完全被傾倒入罐底以后，攪拌器需要調(diào)整至高速。8）關(guān)閉罐口，使給料罐可以進行滅菌。9）給料罐自動被潔凈蒸汽加熱到95℃，為了降低振動需要在潔凈蒸汽中混入一些空氣。10）繼續(xù)再加熱到滅菌溫度。11）保持在滅菌溫度下設(shè)定的滅菌時間。12）滅菌完成后由操作人員打開冷卻水，進行冷卻。13）冷卻到需求溫度后轉(zhuǎn)移至下一級發(fā)酵罐。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

培養(yǎng)箱用于最初的細(xì)胞培養(yǎng)，是一個單獨的設(shè)備。細(xì)胞在錐形瓶中的培養(yǎng)基里面增長并且在恒溫恒濕的環(huán)境下，培養(yǎng)箱通過控制溫度達到細(xì)胞培養(yǎng)的最佳環(huán)境。因此培養(yǎng)箱內(nèi)部溫度的恒定性驗證需要通過驗證儀來校驗合格。

2.4 種子發(fā)酵

種子發(fā)酵罐用于生物轉(zhuǎn)換糖和營養(yǎng)物質(zhì)進入到產(chǎn)品中而進行生物發(fā)酵。營養(yǎng)液在種子發(fā)酵罐中進行滅菌，然后加入預(yù)滅菌的蔗糖溶液，在發(fā)酵罐被潔凈蒸汽冷凝水充滿之前，接種物質(zhì)開始接種到種子發(fā)酵罐當(dāng)中。種子發(fā)酵完成后形成的種子液體培養(yǎng)基將會轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的主發(fā)酵罐中進行進一步的發(fā)酵。

具體操作流程為：

1）培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移。2）稱量電極已校驗，閥門已連接好。3）將混料罐和主發(fā)酵罐通過軟管連接好，將混料罐中的溶液轉(zhuǎn)移至主發(fā)酵罐當(dāng)中達到規(guī)定的液位值。4）攪拌器調(diào)至一定轉(zhuǎn)速。5）確保儲罐，閥門達到可以滅菌狀態(tài)包括冷卻夾套和盤管的放凈。6）滅菌：過程分為三個階段：加熱排除空氣；加熱到95℃排除空氣；繼續(xù)加熱到121～125℃，保持滅菌一定時間。整個過程通過PLC來控制。7）冷卻：關(guān)閉蒸汽開啟潔凈空氣避免發(fā)酵罐壓力過大。8）壓力保持一定冷卻到控制的發(fā)酵溫度。9）消毒后pH值調(diào)整：消毒后通過加入磷酸來調(diào)整pH值4～9。10）接種之前加入維生素和NaOH。11）從給料罐中加入一定量的蔗糖溶液。12）接種：將接種物質(zhì)從罐口加入。13）發(fā)酵：保持合適的溫度20～45℃，攪拌速度，壓力0～1bar和空氣流量。14）接種轉(zhuǎn)移：通過輸送管道轉(zhuǎn)移至主發(fā)酵罐。15）在線清洗：接種液傳輸完畢，進行在線清洗，以防止交叉污染。

2.5 主發(fā)酵過程

主發(fā)酵過程與種子發(fā)酵過程相似。主發(fā)酵罐用于生物轉(zhuǎn)換糖和營養(yǎng)物質(zhì)進入到產(chǎn)品中進行生物發(fā)酵。營養(yǎng)液在主發(fā)酵罐中進行滅菌，然后加入預(yù)滅菌的蔗糖溶液，在發(fā)酵罐被潔凈蒸汽冷凝水充滿之前，接種物質(zhì)開始接種到主發(fā)酵罐當(dāng)中。主發(fā)酵完成后形成的溶液轉(zhuǎn)移至下一步提取過程中。

具體操作流程為：

1）培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移。2）稱量電極已校驗，閥門已連接好。3）將混料罐和主發(fā)酵罐通過軟管連接好，將混料罐中的溶液轉(zhuǎn)移至主發(fā)酵罐當(dāng)中達到規(guī)定的液位值。4）攪拌器調(diào)至一定轉(zhuǎn)速。5）確保儲罐，閥門達到可以滅菌狀態(tài)包括冷卻夾套和盤管的放凈。6）滅菌，過程分為三個階段：加熱排除空氣；加熱到95℃排除空氣；繼續(xù)加熱到121～125℃，保持滅菌一定時間。整個過程通過PLC來控制。7）冷卻：關(guān)閉蒸汽開啟潔凈空氣避免發(fā)酵罐壓力過大。8）壓力保持一定冷卻到控制的發(fā)酵溫度。9）消毒后pH值調(diào)整：消毒后通過加入磷酸來調(diào)整pH值4～9。10）接種之前加入維生素和NaOH。11）從給料罐中加入一定量的蔗糖溶液。12）接種：對種子罐到主發(fā)酵罐的傳輸管道滅菌。13）溶液從種子發(fā)酵罐轉(zhuǎn)移至主發(fā)酵罐。14）發(fā)酵：pH值通過NH3或者H3PO4控制。15）蔗糖的加入通過溶解氧來控制適宜的流量。16）泡沫監(jiān)測器監(jiān)測到泡沫需要手動加入止泡劑。17）保持合適的溫度20～45℃，攪拌速度，壓力0～1bar和空氣流量。18）收獲：收獲過程中主發(fā)酵罐通過潔凈空氣保持一定的壓力。19）將主發(fā)酵罐連接到下游提取相應(yīng)的設(shè)備。20）在線清洗：接種液傳輸完畢，進行在線清洗，以防止交叉污染；在線清洗站自動完成主發(fā)酵罐的在線清洗。

3 結(jié)語

經(jīng)過上述發(fā)酵過程，所得發(fā)酵液經(jīng)過過濾、提取、干燥即可得到透明質(zhì)酸粉末狀成品。整個工藝過程穩(wěn)定可控，可根據(jù)具體產(chǎn)量要求放大或縮小生產(chǎn)規(guī)模。