朱 瀅 孫曉萌 王 云 鞏堯瑤 林 琳

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科(210029)

結(jié)腸動(dòng)力障礙是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常見慢性并發(fā)癥之一，約75%的DM患者伴有胃腸動(dòng)力障礙［1-2］。近年發(fā)現(xiàn)，糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)在DM患者體內(nèi)顯著升高［3］。目前對(duì)AGEs在DM并發(fā)癥中作用的研究主要集中于DM腎病和心血管病，而對(duì)DM胃腸動(dòng)力障礙方面的研究較少［4-5］。平滑肌是維持胃腸道運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ)，磷酸化肌球蛋白輕鏈(phosphorylated myosin light chain，p-MLC)是平滑肌收縮的重要因素［6-7］。研究［8］發(fā)現(xiàn)，MLC 信號(hào)通路異常在DM血管病變中發(fā)揮重要作用，但對(duì)DM胃腸動(dòng)力障礙的作用尚未明確。本文通過探討DM大鼠結(jié)腸組織中MLC磷酸化與結(jié)腸動(dòng)力的關(guān)系，以及AGEs對(duì)MLC磷酸化的影響，旨在為闡明DM腸道動(dòng)力障礙提供依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

清潔級(jí)Sprague-Dawley雄性大鼠16只，5周齡，體質(zhì)量約150 g，由南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。鏈脲菌素、生物素-卵血清-HRP復(fù)合物、乙酰膽堿購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;p-MLC兔抗鼠多克隆抗體、總肌球蛋白輕鏈(t-MLC)兔抗鼠多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;AGEs購(gòu)自美國(guó)Merck Millipore公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.DM動(dòng)物模型建立:16只大鼠隨機(jī)分為DM組和正常對(duì)照組，每組各8只，DM組參照 Wang等［9］的研究給予單次腹腔注射鏈脲菌素60 mg/kg建立DM大鼠模型，正常對(duì)照組單次腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液。一周后檢測(cè)大鼠尾靜脈血糖水平，血糖＞16.7 mmol/L提示造模成功。

2.結(jié)腸組織標(biāo)本采集:參考Wang等［9］的研究于造模8周后以頸椎脫臼法處死DM組和正常對(duì)照組大鼠，取大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸組織于4%多聚甲醛固定或－80℃冰箱保存待測(cè)。

3.離體結(jié)腸肌條肌張力檢測(cè):取大鼠結(jié)腸組織剝除黏膜層，沿環(huán)形肌方向制備成0.2 cm×1 cm肌條，置于 Tyrode緩沖液浴槽(37 ℃、95%O2、5%CO2)，肌條一端固定，一端連接傳感器，給予1 g前負(fù)荷，平衡1 h，加入1 ×10-3mol/L 乙酰膽堿10 μL，待肌條節(jié)律收縮后，記錄肌條肌張力變化。

4.免疫組化染色檢測(cè)結(jié)腸組織p-MLC表達(dá):取結(jié)腸組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟、水化，抗原熱修復(fù)，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑孵育;滴加p-MLC抗體(1∶150)，4℃孵育48 h;滴加生物素標(biāo)記的二抗(1∶500)，室溫孵育 3 h，滴加生物素-卵血清-HRP復(fù)合物(1∶500)，室溫孵育3 h;DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知陽性切片作為陽性對(duì)照。

5.蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)腸組織p-MLC、t-MLC表達(dá):提取結(jié)腸組織總蛋白，裂解液冰裂解30 min，以BCA法測(cè)定蛋白濃度，取50 μg蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入p-MLC 抗體(1∶500)、t-MLC 抗體(1∶1000)，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h，ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照、分析。MLC磷酸化水平以p-MLC/t-MLC/β-actin表示。

6.結(jié)腸平滑肌細(xì)胞(SMCs)分離培養(yǎng):正常對(duì)照組大鼠處死后，距肛門端2 cm處取結(jié)腸組織10 cm，以Hepes-Ringer緩沖液反復(fù)沖洗，去除黏膜層和漿膜層，剪碎平滑肌組織，加入消化液，1500 r/min離心5 min，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞、過篩，接種于培養(yǎng)皿于37℃、95%O2、5%CO2條件下培養(yǎng)，待SMCs長(zhǎng)至致密單層時(shí)，以PBS沖洗，加入無血清的DMEM培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)12 h。

7.蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè) SMCs的 p-MLC、t-MLC表達(dá):取SMCs分為AGEs不同濃度處理組和不同時(shí)間處理組，前者分別以 AGEs 0、10、50、100 μg/mL干預(yù)SMCs 30 min，后者分別以 AGEs 50 μg/mL干預(yù) SMCs 0、15、30、60 min，以蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)SMCs的p-MLC、t-MLC表達(dá)，實(shí)驗(yàn)方法同步驟5。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、DM模型驗(yàn)證

DM組大鼠血糖均＞16.7 mmol/L，提示造模成功。DM組血糖水平較正常對(duì)照組顯著升高［(28.12 ±2.33)mmol/L 對(duì)(6.92 ± 1.31)mmol/L，P ＜0.01］，體質(zhì)量顯著減低［(368.21 ±12.32)g對(duì)(512.62 ±15.44)g，P ＜0.01］。

二、結(jié)腸肌條肌張力變化

乙酰膽堿作用后，與正常對(duì)照組相比，DM組大鼠結(jié)腸平滑肌張力顯著減弱［(0.89±0.09)g對(duì)(1.98 ±0.12)g，P ＜0.05］。

三、結(jié)腸組織p-MLC表達(dá)情況

免疫組化染色結(jié)果顯示，p-MLC陽性染色表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈棕色顆粒樣，主要位于黏膜肌層和肌層。DM組大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸組織p-MLC表達(dá)水平較正常對(duì)照組減少，以黏膜肌層、環(huán)肌層減少最為顯著(見圖1)。

圖1 結(jié)腸組織p-MLC表達(dá)情況(免疫組化染色，×200)

四、結(jié)腸組織MLC磷酸化水平

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，DM組大鼠結(jié)腸組織p-MLC/t-MLC/β-actin水平顯著降低(0.98 ± 0.10 對(duì) 1.61 ± 0.12，P ＜ 0.05)(見圖2)。

圖2 結(jié)腸組織p-MLC、t-MLC表達(dá)水平(蛋白質(zhì)印跡法)

五、不同濃度AGEs對(duì)SMCs中MLC磷酸化水平的影響

與 AGEs 0 μg/mL 組相比，AGEs 10、50 μg/mL組p-MLC/t-MLC/β-actin水平顯著降低 (0.63±0.01、0.45 ±0.02 對(duì) 1.05 ±0.03，P ＜0.05)，AGEs 100 μg/mL組與 AGEs 0 μg/mL組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)(見圖3)。

圖3 不同濃度AGEs對(duì)SMCs中p-MLC、t-MLC表達(dá)水平的影響(蛋白質(zhì)印跡法)

六、不同作用時(shí)間AGEs對(duì)SMCs中MLC磷酸化水平的影響

與 AGEs 0 min組相比，AGEs 30、60 min組p-MLC/t-MLC/β-actin 水平顯著降低(0.26 ±0.04、0.25± 0.02 對(duì) 0.92 ± 0.05，P ＜ 0.05)。AGEs 15 min組與AGEs 0 min組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)(見圖4)。

圖4 不同作用時(shí)間AGEs對(duì)SMCs中p-MLC、t-MLC表達(dá)水平的影響(蛋白質(zhì)印跡法)

討 論

DM結(jié)腸動(dòng)力障礙表現(xiàn)為結(jié)腸張力和收縮力降低、蠕動(dòng)減慢、排空延遲［10］。平滑肌是胃腸運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ)，平滑肌收縮功能改變與DM結(jié)腸動(dòng)力障礙密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，DM大鼠結(jié)腸平滑肌張力減低，證實(shí)DM大鼠伴有結(jié)腸動(dòng)力障礙。同時(shí)發(fā)現(xiàn)結(jié)腸組織p-MLC表達(dá)減少，MLC磷酸化水平減低，表明DM大鼠結(jié)腸動(dòng)力障礙由p-MLC減少所致。進(jìn)一步行離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AGEs可抑制SMCs發(fā)生MLC磷酸化。上述研究提示DM患者結(jié)腸動(dòng)力障礙與其體內(nèi)AGEs水平升高，抑制SMCs MLC磷酸化，從而減弱結(jié)腸平滑肌張力有關(guān)。

AGEs是蛋白質(zhì)和脂類經(jīng)非酶糖基化后生成的含多種結(jié)構(gòu)分子的混合物，AGEs可通過受體依賴性和受體非依賴性途徑促進(jìn)DM并發(fā)癥發(fā)生［11］，其不僅與蛋白質(zhì)結(jié)合，亦可通過與核酸、脂質(zhì)結(jié)合，參與DM并發(fā)癥形成。此外，AGEs可激活一系列信號(hào)通路，促進(jìn)炎性因子、氧化產(chǎn)物生成增加，導(dǎo)致組織器官損傷，在DM并發(fā)癥中發(fā)揮重要作用［12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)AGEs可抑制SMCs的MLC磷酸化，從而影響結(jié)腸平滑肌張力，然而由于尚不明確AGEs的特異性受體拮抗劑，因此未能證明AGEs作用的相關(guān)信號(hào)通路。

MLC磷酸化是決定平滑肌收縮的重要因素，其可縮短肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白間的橫橋周期，引起平滑肌收縮。MLC磷酸化受肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)正向調(diào)節(jié)和肌球蛋白輕鏈磷酸酶(MLCP)負(fù)向調(diào)節(jié)，后者使其去磷酸化，從而導(dǎo)致平滑肌松弛［14-16］。研究［17-18］顯示，DM大鼠幽門、回腸動(dòng)力減弱伴MLCK表達(dá)減少;DM大鼠尾動(dòng)脈收縮功能減弱伴p-MLC表達(dá)減少;DM兔膀胱平滑肌收縮功能減弱伴p-MLC表達(dá)升高，提示p-MLC和MLCK在不同組織中的表達(dá)水平和作用效應(yīng)有所不同，相關(guān)機(jī)制需進(jìn)一步研究。本研究證實(shí)DM大鼠結(jié)腸動(dòng)力障礙伴有結(jié)腸組織p-MLC表達(dá)減少，但未進(jìn)一步研究MLCK和MLCP在此過程中的作用，擬在后續(xù)研究中闡明。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，DM大鼠結(jié)腸動(dòng)力障礙可能由AGEs抑制SMCs中的MLC磷酸化所致。然而，此過程中仍有部分機(jī)制未完全明了，如AGEs降低p-MLC表達(dá)的信號(hào)通路，MLCK、MLCP對(duì)p-MLC的調(diào)節(jié)效應(yīng)等，有待未來進(jìn)一步研究深入探討。

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