王 敏

（中國科學院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所，福建 福州 350002）

扁桃酸系列化合物既是一類具有廣泛用途的醫(yī)藥、化工產(chǎn)品，又是制備化學中重要的合成砌塊。該類化合物含有一個手性中心，具有左旋和右旋兩種光學異構(gòu)體，其單一光學對映體在生物活性上通常存在較大差異，因此對扁桃酸系列化合物的拆分研究具有很重要的意義［1-4］。目前，關(guān)于扁桃酸的拆分方法已發(fā)展為化學拆分、酶拆分、色譜拆分、分子印跡拆分、毛細管電泳拆分等［1，2］。前兩種拆分方法主要用于生產(chǎn)制備，后3種拆分方法主要用于分析檢測。其中，液相色譜拆分法因具有高選擇性、高穩(wěn)定性、高效率等諸多優(yōu)勢，在手性分析檢測中占有重要席位［5-8］。在高效液相色譜(HPLC)中，采用商品化的淀粉型手性固定相和纖維素型手性固定相拆分個別扁桃酸化合物雖已有一些報道［9-14］，但是對于一系列結(jié)構(gòu)極為相似的扁桃酸化合物的手性拆分的系統(tǒng)研究還未見報道。

本文在纖維素型手性固定相Chiralpak AD-H和淀粉型手性固定相Chiralcel OJ-H手性柱上對8個扁桃酸化合物(結(jié)構(gòu)如圖1所示)進行了拆分對比研究，考察了扁桃酸系列化合物苯環(huán)上的取代基對其在手性固定相上被識別的難易程度的影響，并探討了手性拆分機理。該研究可為一些實際光學活性扁桃酸及其類似物的對映體純度測定與拆分研究提供參考。

圖1 扁桃酸系列化合物的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of the mandelic acid and its analogs

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

日本島津公司的LC-20AD高效液相色譜儀，配有光電二極管陣列(PDA)檢測器、手動進樣器、手性柱 Chiralcel OJ-H(250 mm ×4.6 mm，5 μm)和Chiralpak AD-H(250 mm ×4.6 mm，5 μm)。

正己烷、異丙醇(iPrOH)為HPLC純(德國默克公司)；三氟乙酸(TFA)為分析純(中國國藥集團化學試劑公司)；扁桃酸、2-氯扁桃酸、3-氯扁桃酸、4-氯扁桃酸、4-氟扁桃酸、4-溴扁桃酸、4-三氟甲基扁桃酸和4-甲氧基扁桃酸外消旋標準品均為分析純(Aldrich公司)。

1.2 標準溶液的配制

稱量外消旋標準品5 mg，溶于5 mL異丙醇中，溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用異丙醇定容至刻度，搖勻，獲取質(zhì)量濃度為500 mg/L的外消旋標準溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱為Chiralcel OJ-H柱和Chiralpak AD-H。流動相為不同配比的正己烷-異丙醇-三氟乙酸混合物，用前經(jīng)過0.45 μm微孔濾膜過濾，并超聲脫氣30 min；流速1 mL/min。檢測波長為210～230 nm范圍內(nèi)每個化合物的最大吸收波長值；柱溫35℃；進樣體積10 μL。色譜死時間通過進樣 1，3，5-三叔丁基苯測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 Chiralpak AD-H手性柱對扁桃酸系列化合物的拆分

在正相條件下，采用分離酸性物質(zhì)常用的流動相配比，以正己烷-異丙醇-三氟乙酸(90∶10∶0.1，v/v/v)為流動相，首先考察了8個扁桃酸化合物在手性柱Chiralpak AD-H上的拆分情況(見表1)。如表1所示，在上述條件下Chiralpak AD-H手性固定相對扁桃酸對映體的選擇性識別能力最強(分離因子(α)最大，為1.20)；對帶有取代基的扁桃酸對映體的選擇性識別能力都有不同程度的下降，其中對2-氯扁桃酸對映體的選擇性識別能力最強(α為1.10)，對3-氯扁桃酸、4-甲氧基扁桃酸、4-氟扁桃酸對映體的選擇性識別能力依次降低(α依次為1.09、1.07、1.05)，對 4-氯扁桃酸、4-溴扁桃酸和 4-三氟甲基扁桃酸對映體沒有選擇性(α為1.00)。在上述條件下，8個外消旋扁桃酸化合物中扁桃酸獲得了最大分離度(Rs為2.86)，2-氯扁桃酸實現(xiàn)了基線分離(Rs為1.60)，3-氯扁桃酸和4-甲氧基扁桃酸實現(xiàn)了基本分離(1.0＜Rs＜1.5)，4-氟扁桃酸僅有小部分分離(Rs為0.34)，4-氯扁桃酸、4-溴扁桃酸和4-三氟甲基扁桃酸則完全沒有被分離(Rs為0)。3-氯扁桃酸和4-甲氧基扁桃酸在優(yōu)化的流動相正己烷-異丙醇-三氟乙酸(95∶5∶0.1，v/v/v)條件下可以實現(xiàn)基線分離，分離度分別為1.83和2.07，而對于扁桃酸系列化合物4～7(見圖1)，距離實現(xiàn)基線分離的目標差距太大，即使再優(yōu)化條件也很難達到。更換適宜的手性柱是較快實現(xiàn)該系列 化合物基線分離目標的方法。典型色譜圖見圖2。

表1 不同配比的流動相體系下外消旋扁桃酸系列化合物在Chiralpak AD-H手性柱上的拆分Table 1 Enantioseparations of racemic mandelic acid and its analogs on a Chiralpak AD-H column by using various mixtures of hexane-isopropanol-TFA as mobile phases

圖2 8種扁桃酸系列化合物在Chiralpak AD-H柱上拆分的典型色譜圖Fig.2 Typical chromatograms of enantioseparations of the eight mandelic acid compounds on a Chiralpak AD-H column

2.2 Chiralcel OJ-H手性柱對扁桃酸系列化合物的拆分

在淀粉型手性固定相Chiralcel OJ-H柱上我們首先考察了在Chiralpak AD-H柱上不能分離的扁桃酸化合物4～7的拆分情況。如表2所示，以正己烷-異丙醇-三氟乙酸(95∶5∶0.1，v/v/v)為流動相，上述4個外消旋化合物都能達到基線分離。在同樣色譜條件下，2-氯扁桃酸和3-氯扁桃酸也得到了很好的拆分(Rs＞4)，但是分析時間偏長，2-氯扁桃酸的拆分需要50 min；增加流動相中極性溶劑異丙醇的比例，將流動相調(diào)整為正己烷-異丙醇-三氟乙酸(90∶10∶0.1，v/v/v)，2-氯扁桃酸的拆分在 20 min內(nèi)即可完成，且分離因子基本不變，分離度仍然很高(Rs=4.26)。在流動相為正己烷-異丙醇-三氟乙酸(90∶10∶0.1，v/v/v)條件下，其余 3 種扁桃酸化合物1、3和8都可以被完全地拆分。典型色譜圖見圖3。

表2 不同配比的流動相體系下外消旋扁桃酸系列化合物在Chiralcel OJ-H手性柱上的拆分Table 2 Enantioseparations of racemic mandelic acid and its analogs on a Chiralcel OJ-H column by using various mixtures of hexane-isopropanol-TFA as mobile phases

圖3 8種扁桃酸系列化合物在Chiralcel OJ-H柱上拆分的典型色譜圖Fig.3 Typical chromatograms of enantioseparations of the eight mandelic acid compounds on a Chiralcel OJ-H column

2.3 Chiralpak AD-H和Chiralcel OJ-H手性柱的拆分對比和拆分機理探討

通過對比可以發(fā)現(xiàn)兩種類型的手性柱對扁桃酸系列化合物的拆分情況有同有異。共同點是在相同的色譜條件下所有被測扁桃酸類化合物在淀粉型手性固定相Chiralcel OJ-H柱上的保留時間都大于在纖維素型手性固定相Chiralpak AD-H柱上的保留時間；增加流動相中極性溶劑異丙醇的比例都可以縮短分析時間，減小拆分底物的分離度。不同點在于兩種手性柱對扁桃酸系列化合物的拆分選擇性不同，Chiralpak AD-H柱對扁桃酸和2-氯扁桃酸的拆分能力較強，對3-氯扁桃酸、4-甲氧基扁桃酸稍低，對對位帶有吸電子基團的扁桃酸化合物4～7的拆分能力最弱，很難使其實現(xiàn)基線分離；而Chiralcel OJ-H柱則是對2-氯扁桃酸、3-氯扁桃酸和扁桃酸的拆分能力較強，對4-氟扁桃酸、4-甲氧基扁桃酸和4-三氟甲基扁桃酸稍低，對4-氯扁桃酸和4-溴扁桃酸較弱，但對8個外消旋扁桃酸化合物都能實現(xiàn)基線分離。相比之下，Chiralcel OJ-H柱對每個底物的拆分能力都大于Chiralpak AD-H柱，對扁桃酸系列化合物顯示了更強的手性識別能力。

淀粉型和纖維素型手性固定相的拆分機理目前尚不完全清楚，一般認為是與對映體之間存在氫鍵-氫鍵、偶極-偶極、π-π作用等作用力，除此之外，還有內(nèi)部手性空腔(由固定相的構(gòu)成單元葡萄糖單元形成多糖單手螺旋結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生)與溶質(zhì)的空間適應性［15］。這些作用力的綜合作用結(jié)果將影響固定相與兩個對映體之間形成的瞬時的非對映體復合物的穩(wěn)定性并產(chǎn)生差異而得到分離［16］。

本文中Chiralpak AD-H柱和Chiralcel OJ-H柱對扁桃酸系列化合物的拆分可能是受扁桃酸的羥基和羧基和固定相之間形成的氫鍵、苯基和固定相芳環(huán)部分之間存在的π-π作用以及扁桃酸與固定相內(nèi)部手性空腔的空間適應性等作用力綜合作用的結(jié)果。8個扁桃酸系列化合物在結(jié)構(gòu)上十分相似，差異僅在于苯環(huán)上的取代基的位置或種類不同，但它們被手性拆分的難易程度卻相差很大，說明識別過程中取代基起到了非常重要的作用。首先，取代基的電子誘導效應影響了扁桃酸類化合物在固定相上的保留時間。帶有吸電子基團特別是在對位帶有吸電子取代基的化合物其吸電子誘導效應導致扁桃酸的羥基和羧基部分電荷密度降低，從而削弱了與手性固定相形成的氫鍵相互作用，降低了固定相與兩個對映體之間形成的瞬時的非對映體復合物的穩(wěn)定性，縮短了保留時間，例如4-三氟甲基扁桃酸；帶有供電子基團的化合物的供電子誘導效應會導致扁桃酸的羥基和羧基部分電荷密度升高，從而加強了與手性固定相形成的氫鍵相互作用，增強了固定相與兩個對映體之間形成的瞬時的非對映體復合物的穩(wěn)定性，延長了保留時間，例如4-甲氧基扁桃酸。其次，取代基的空間位阻效應是決定扁桃酸在固定相上被拆分成敗的關(guān)鍵因素之一。具有恰當位阻效應的取代基使得扁桃酸分子與固定相內(nèi)部的手性空腔產(chǎn)生良好的空間適應性將有助于固定相與兩個對映體之間形成的瞬時的非對映體復合物的穩(wěn)定性并產(chǎn)生差異，從而促進手性分離。例如在鄰位有取代基的2-氯扁桃酸與其間位和對位的異構(gòu)體相比，它們與手性固定相之間的氫鍵-氫鍵、偶極-偶極、π-π作用基本無差別，2-氯扁桃酸能得到更好的手性拆分效果的決定因素就是其與手性固定相之間較好的空間適應性。對扁桃酸系列化合物的手性拆分，Chiralcel OJ-H柱比Chiralpak AD-H柱顯示了更強的手性識別能力，分析其原因空間適應性適宜也是主要原因之一。另外，固定相與扁桃酸芳環(huán)之間的π-π相互作用也是影響手性拆分效果的又一因素，Chiralcel OJ-H柱衍生化基團4-甲苯基甲酰基比Chiralpak AD-H柱衍生化基團3，5-二甲苯基氨基甲酰基的位阻要小，更容易貼近扁桃酸分子產(chǎn)生更強的π-π相互作用，因而會增加保留時間，產(chǎn)生更好的拆分效果。綜上所述，Chiralcel OJ-H柱與Chiralpak AD-H柱拆分扁桃酸系列化合物都是基于兩者之間的氫鍵-氫鍵、偶極-偶極、π-π相互作用以及空間適應性等諸多因素綜合影響的拆分機理，其中空間適應性起到至關(guān)重要的作用。

3 結(jié)論

本研究系統(tǒng)地考察了8個扁桃酸系列化合物的外消旋體在Chiralpak AD-H和Chiralcel OJ-H手性柱上的分配行為，發(fā)現(xiàn)Chiralcel OJ-H柱對扁桃酸系列化合物具有更強的手性識別能力；還考察了扁桃酸系列化合物苯環(huán)上的取代基對其在手性固定相上被識別的難易程度的影響，并探討了手性拆分機理。基于Chiralcel OJ-H柱建立了有效的拆分方法，8個外消旋扁桃酸化合物在36 min內(nèi)都得到了基線分離，該方法簡單可靠、準確可行。該研究可為一些實際光學活性扁桃酸及其類似物的對映體純度測定與拆分研究提供參考。

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