唐圣蕓，王遠(yuǎn)興，溫平威，辛 貞

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

N-氨基甲酰-L-谷氨酸(N-carbamyl-L-glutamic acid)簡稱NCG，是一種性質(zhì)穩(wěn)定、安全性高的活性物質(zhì)［1］。它是 N-乙酰-L-谷氨酸 (N-acetyl-L-glutamid acid，NAG)的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似物［2］，結(jié)構(gòu)式見圖1。已有關(guān)于NCG在食品動(dòng)物生產(chǎn)和人類健康方面的深入研究［3］，發(fā)現(xiàn)其可廣泛用作仔豬飼料添加劑，以替代或部分替代Arg［4］。Arg是仔豬的必需氨基酸，極易缺乏，在飼料中添加量較大，成本高，且會干擾 Trp、Lys和 His等其他氨基酸的代謝［5］。而NCG可作為Arg的代謝激活劑，促進(jìn)Arg內(nèi)源合成，從而促進(jìn)幼齡動(dòng)物的生長和發(fā)育，其所用劑量低且效果顯著，同時(shí)避免了對其他氨基酸的干擾［6］。

作為一種潛在的理想飼料添加劑，目前還沒有建立對飼料中NCG的檢測方法，為符合飼料添加劑安全使用規(guī)范和使用劑量，有必要建立一種檢測方法。根據(jù) NCG 的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可采用核磁共振［7，8］和高效液相色譜法［9，10］鑒定和檢測含量。由于配合飼料中的成分多且基質(zhì)復(fù)雜，本研究小組［5］前期采用柱前衍生-高效液相色譜法分析NCG時(shí)發(fā)現(xiàn)基質(zhì)干擾大，分離度比較差。另外，由于NCG的紫外吸收弱，直接采用紫外檢測響應(yīng)度低，靈敏度低［11］。高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-ESI-MS/MS)可克服這些不足［12，13］。因此，本文采用 HPLC-ESIMS/MS對飼料中的NCG含量進(jìn)行了測定。

圖1 (a)N-氨基甲酰-L-谷氨酸和(b)N-乙酰-L-谷氨酸的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of(a)N-carbamyl-L-glutamic acid and(b)N-acetyl-L-glutamic acid

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 6430液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子源(ESI)(美國Agilent公司)；渦輪振蕩器(太倉市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；高速離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司)；超聲提取儀(昆山市超聲儀器有限公司)；固相萃取儀(廣州智真生物科技公司)等。

NCG標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)購于Sigma公司；分析純甲醇、三氯甲烷、正己烷、25%(v/v)氨水溶液均由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；色譜純甲酸、甲醇，純度均大于99.9%，購自 Merck KGaA公司；超純水由Milli-Q超純水儀(Millipore公司)制備。色譜柱Unimicro C18(Unimicro Technologies公司)；混合型強(qiáng)陰離子交換反相固相萃取柱(ProElut PXA，60 mg/3 mL)購自北京迪馬科技有限公司；50 mL聚丙烯塑料離心管(北京科友佳生物技術(shù)有限公司)。

稱取NCG標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg于50 mL棕色容量瓶中，用純水溶解并定容，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4℃下保存，有效期為1個(gè)月。

飼料樣品由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 樣品前處理方法

1.2.1 提取

［14，15］對飼料中目標(biāo)物的提取方法，依據(jù)NCG的理化性質(zhì)進(jìn)行改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取2 g(精確至0.1 mg)粉碎后的飼料樣品于50 mL聚丙烯塑料離心管中，加入10 mL甲醇，超聲提取15 min(每隔5 min振蕩混勻)，以4000 r/min離心10 min，上清液全部轉(zhuǎn)移到另一離心管中。用上述方法對殘?jiān)貜?fù)提取1次，合并上清液。在合并的上清液中加入400 μL 5%(v/v)的氨水溶液后，準(zhǔn)確移取 1 mL，用甲醇定容至50 mL，混勻。準(zhǔn)確移取3.0 mL上述溶液，待凈化。

1.2.2 凈化

依次用3 mL甲醇和3 mL水活化固相萃取小柱(ProElut PXA，60 mg/3 mL)，將3.0 mL待凈化上清液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，再依次用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，抽至近干，用5 mL含2%(v/v)甲酸的甲醇溶液洗脫，收集洗脫液。經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，供上機(jī)測定。

1.3 HPLC-MS/MS 條件

HPLC條件 色譜柱:Unimicro C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相:甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液(5∶95，v/v)；柱溫:20 ℃；流速:0.6 mL/min；進(jìn)樣量:10 μL。

質(zhì)譜條件 電離源:電噴霧離子源(ESI)；掃描模式:正離子掃描模式(positive)；檢測方式:多反應(yīng)檢測(MRM)；毛細(xì)管電壓:4.0 kV；離子源溫度:100℃；干燥氣溫度:300℃；干燥氣流量:11 L/min；霧化氣壓力:1.03×105Pa。NCG的檢測離子對、碎裂電壓(fragmentor)、碰撞能量(collision energy)等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.4 加標(biāo)回收試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取2 g(精確至0.1 mg)飼料樣品，添加適量NCG標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混勻后靜置10 min，按照1.2節(jié)所述的前處理方法進(jìn)行提取和凈化后，按照1.3節(jié)所述條件進(jìn)行HPLC-MS/MS檢測。為使標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液具有相同的基質(zhì)，使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，根據(jù)添加標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積計(jì)算回收率。

表1 N-氨基甲酰-L-谷氨酸的質(zhì)譜檢測參數(shù)Table 1 MS parameters for the determination of N-carbamyl-L-glutamic acid

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)NCG的分子結(jié)構(gòu)特征，在電噴霧正離子模式下對NCG標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行一級質(zhì)譜分析(Q1掃描)，其一級質(zhì)譜圖見圖2；再以m/z 191.0作為母離子，進(jìn)行二級質(zhì)譜分析(子離子掃描)，得到碎片離子(子離子)信息。然后對NCG二級質(zhì)譜的源內(nèi)碎裂電壓、碰撞氣能量等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，使NCG的母離子和特征碎片離子產(chǎn)生的離子對強(qiáng)度最大且穩(wěn)定時(shí)為佳。再按照二級質(zhì)譜圖提供的碎片離子信息，選擇最優(yōu)離子對進(jìn)行定性和定量。其優(yōu)化后質(zhì)譜參數(shù)見表1，二級質(zhì)譜圖見圖3。

圖2 N-氨基甲酰-L-谷氨酸的一級質(zhì)譜圖Fig.2 MS spectrum of N-carbamyl-L-glutamic acid

2.2 色譜分離條件的優(yōu)化

進(jìn)行HPLC-MS/MS分析時(shí)，流動(dòng)相的選擇對色譜分析效果和檢測靈敏度都有很大的影響。分別選用甲醇水溶液和乙腈水溶液作為流動(dòng)相，對比后發(fā)現(xiàn)以甲醇水溶液為流動(dòng)相時(shí)分析物的峰形更好，所以選擇甲醇水溶液。NCG呈弱酸性，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在流動(dòng)相中加入少量甲酸可以提高其電噴霧離子化效率，從而提高靈敏度，同時(shí)峰形更好。最終確定如1.3節(jié)所述的流動(dòng)相條件，進(jìn)行等度分析。

圖3 N-氨基甲酰-L-谷氨酸的二級質(zhì)譜圖Fig.3 MS/MS spectrum of N-carbamyl-L-glutamic acid

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇

因NCG易溶于水和甲醇中，實(shí)驗(yàn)對比了水、甲醇水溶液(1∶1，v/v)和甲醇作為提取溶劑的效果。發(fā)現(xiàn)以水和甲醇水溶液作為提取溶劑時(shí)，雜質(zhì)更多，干擾比較大，且回收率較低；而以甲醇作提取劑時(shí)，干擾相對較小，回收率最好。這可能是由于飼料中大多數(shù)添加藥物呈水溶性，更易溶于水，而不溶于甲醇中。因此，實(shí)驗(yàn)最終選擇甲醇為提取溶劑。

2.3.2 固相萃取柱的選擇

由于飼料中添加了較多藥物，成分復(fù)雜，使得樣品的初提取液中雜質(zhì)較多，直接測定容易對目標(biāo)化合物造成干擾。為了提高靈敏度和降低檢出限，對樣品初提取液進(jìn)一步凈化處理。實(shí)驗(yàn)中比較了液-液萃取法和固相萃取法(SPE)兩種方法，發(fā)現(xiàn)用三氯甲烷和正己烷分別進(jìn)行液-液萃取時(shí)，去除基質(zhì)效果不明顯，回收率也較低，而且萃取時(shí)需消耗大量的有機(jī)溶劑，不經(jīng)濟(jì)且對環(huán)境造成污染，而SPE法更具有優(yōu)勢。所以本實(shí)驗(yàn)采用SPE法進(jìn)行純化富集。

分別使用反相硅膠鍵合吸附固相萃取柱(ProE-lut C18，200 mg/3 mL，北京迪馬科技有限公司)、ProElut C18-U柱(200 mg/3 mL，北京迪馬科技有限公司)和PXA柱進(jìn)行凈化，比較固相萃取的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C18柱和C18-U柱對目標(biāo)化合物的凈化效果好，有一定的吸附能力，但其回收率都比較低，分別為37.6%和48.5%，難以滿足要求；而PXA柱的凈化效果較好，對目標(biāo)化合物的吸附能力很強(qiáng)，回收率為95.3%。故本實(shí)驗(yàn)最終采用PXA柱凈化。

2.3.3 洗脫條件的選擇

由于PXA易吸附陰離子，而NCG為酸性化合物，在樣品初提取液中加入適量的氨水溶液可使NCG呈陰離子形態(tài)，更易吸附在PXA柱上。用3 mL甲醇活化PXA柱，3 mL 0.1%(v/v)的氨水溶液平衡，上樣后依次用3 mL超純水和3 mL甲醇淋洗，抽干后用5 mL含2%(v/v)甲酸的甲醇溶液洗脫，發(fā)現(xiàn)回收率很低。而改用3 mL的純水進(jìn)行平衡，發(fā)現(xiàn)回收率很理想。分別選擇了上樣3、4和5 mL作比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上樣3 mL時(shí)的回收率最高，為95.3%；而上樣4 mL和5 mL時(shí)回收率不理想，分別為78.9%和65.6%?？赡苁怯捎赑XA柱對飼料中的某些藥物的吸附能力也比較強(qiáng)，而其吸附容量有限，造成回收率降低，所以選擇上樣量為3 mL。

2.4 方法的線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量限

稱取陰性飼料樣品，按照1.2節(jié)所述方法步驟進(jìn)行操作，制得樣品提取液。用樣品提取液對標(biāo)準(zhǔn)儲備液進(jìn)行稀釋，得到含量分別為20、50、100、200、500、1000 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

為了消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，使用以上基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照優(yōu)化后的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，外標(biāo)法定量。以NCG特征碎片離子的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X，μg/L)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。其相應(yīng)的線性回歸方程為 Y=8.1921 X-7.5459，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.9999。結(jié)果表明 NCG在20～1000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。在陰性飼料中添加80 μg/kg的NCG標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測定，信噪比大于10，因此確定方法的定量限為80 μg/kg；以信噪比大于3確定檢出限為24 μg/kg。

2.5 方法的回收率和精密度

準(zhǔn)確稱取飼料樣品，在80、200、500 mg/kg等3個(gè)水平做添加回收試驗(yàn)，每個(gè)添加水平做5個(gè)平行樣品。NCG在飼料中的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見表2，3個(gè)添加水平的回收率在95.3%和104.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.8%和7.5%之間，滿足飼料中NCG的定量分析要求。NCG加標(biāo)水平為80 μg/kg的陰性飼料的多反應(yīng)監(jiān)測掃描色譜圖見圖4。

表2 不同加標(biāo)水平下N-氨基甲酰-L-谷氨酸的回收率和RSD(n=5)Table 2 Recoveries and RSDs of N-carbamyl-L-glutamic acid at different spiked levels(n=5)

2.6 方法的應(yīng)用

運(yùn)用本文建立的方法，對5份仔豬飼料樣品和5份普通豬飼料樣品中的NCG進(jìn)行了檢測，最終5份仔豬飼料樣品中均檢出NCG，平均含量為309.5 mg/kg，而普通豬飼料樣品中均未檢出NCG。

圖4 陰性加標(biāo)(80 μg/kg的N-氨基甲酰-L-谷氨酸)飼料的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.4 MRM chromatogram of a negative feedstuff sample spiked with N-carbamyl-L-glutamic acid at 80 μg/kg

3 結(jié)論

本文根據(jù)飼料樣品和NCG的特點(diǎn)，采用甲醇超聲提取，混合型強(qiáng)陰離子交換反相固相萃取柱凈化，利用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法在MRM模式下進(jìn)行定量分析，成功建立了飼料中NCG含量的檢測方法。該方法操作簡單，所需溶劑少，樣品前處理方便迅速、可操作性高，檢測速度快，其靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均較高，滿足飼料中NCG的分析檢測要求，完全達(dá)到了預(yù)期目標(biāo)，可為日后建立飼料中NCG含量測定的國家標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

參考文獻(xiàn):

［1］Kim S W，McPherson R L，Wu G.J Nutr，2004，134(3):625

［2］Wu G，Knabe D A，Kim S W.J Nutr，2004，134(10):2783S

［3］Schwahn B C，Pieterse L，Bisset W M，et al.Eur J Pediatr，2010，169(1):133

［4］Wu X，Ruan Z，Gao Y，et al.Amino Acids，2010，39(3):831

［5］Huang X Q.［MS Dissertation］.Nanchang:Nanchang University(黃新球.［碩士學(xué)位論文］.南昌:南昌大學(xué))，2012

［6］Liu Z Q，Geng M，Shu X G，et al.J Food Agric Environ，2012，10:408

［7］Deng Z W，Li J，Xu M F，et al.Journal of Instrumental Analysis(鄧志威，李璟，許美鳳，等.分析測試學(xué)報(bào))，2012，31(9):1081

［8］Pierens G K，Carroll A R，Davis R A，et al.J Nat Prod，2008，71(5):810

［9］Huang Y，Zhang Q J，Liu M，et al.Chinese Journal of Chromatography(黃怡，張青杰，劉敏，等.色譜)，2012，30(1):56

［10］Klinglmayr C，N?bauer K，Razzazi-Fazeli E，et al.J Chromatogr B，2010，878(2):187

［11］Zhu Y T. ［MS Dissertation］.Nanchang:Nanchang University(朱影恬.［碩士學(xué)位論文］.南昌:南昌大學(xué))，2010

［12］Huang F，Ma Y F，Wu H Q，et al.Journal of Instrumental Analysis(黃芳，馬葉芬，吳惠勤，等.分析測試學(xué)報(bào))，2013，32(3):271

［13］Diana Di Mavungu J，Malysheva S V，Sanders M，et al.Food Chem，2012，135(1):292

［14］Yan L J，Zhang F，F(xiàn)ang E H，et al.Chinese Journal of Chromatography(嚴(yán)麗娟，張峰，方恩華，等.色譜)，2010，28(11):1038

［15］Li N，Li H，Shao H，et al.Chinese Journal of Chromatography(李娜，李輝，邵輝，等.色譜)，2011，29(4):346