管遠(yuǎn)紅+張家禾+秦楓+周廣生+左偉勇

摘要：通過(guò)4種中藥復(fù)方對(duì)小鼠的脾臟指數(shù)、體重、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)和吞噬率、溶血素、溶血空斑、淋巴細(xì)胞增殖、血清中一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）的影響作用，測(cè)得不同中藥復(fù)方與對(duì)照組的差異。結(jié)果表明，復(fù)方1對(duì)小鼠的脾臟指數(shù)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)、血液中溶血素水平差異顯著，復(fù)方2對(duì)小鼠的脾臟指數(shù)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率、血液中溶血素和溶血空斑差異顯著；復(fù)方3對(duì)小鼠吞噬指數(shù)、血液中溶血素和溶血空斑、淋巴細(xì)胞增殖（ConA）差異顯著；復(fù)方4對(duì)小鼠的脾臟指數(shù)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)、血液中溶血素和溶血空斑、淋巴細(xì)胞增殖（LPS）、血液中NO和NK細(xì)胞均差異顯著。不同中藥復(fù)方中復(fù)方4的免疫增強(qiáng)作用最強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：中藥復(fù)方；免疫增強(qiáng)；淋巴細(xì)胞增殖；溶血素

中圖分類號(hào)：S852.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2014）08-0224-03

眾所周知，在治療多數(shù)疾病中，西藥作為常選藥物在治療重癥、急癥、疼痛性等疾病中發(fā)揮了不可替代的作用。但與中藥相比，西藥也表現(xiàn)出許多不足，新藥物的開(kāi)發(fā)難度增加，對(duì)機(jī)體的刺激作用和傷害也不容忽視，在治療細(xì)菌性疾病時(shí)容易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性，在殺滅有害菌的同時(shí)對(duì)機(jī)體的有益菌也造成了不同程度的傷害，在治療病毒性疾病時(shí)表現(xiàn)力有所不足，尤其對(duì)新出現(xiàn)的病毒性疾病常常會(huì)在一段時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)無(wú)治療藥物時(shí)期，比如SARS、H1N1、H7N9等疾病，在初發(fā)現(xiàn)時(shí)總是無(wú)特定的藥物治療，只有在一段時(shí)間后才有西藥的研發(fā)產(chǎn)品，這時(shí)人們往往想到的是中藥，如對(duì)板藍(lán)根的搶購(gòu)。與西藥相比，中藥復(fù)方被廣泛用于病毒性傳染病的預(yù)防和治療^[1]。中國(guó)傳統(tǒng)中藥復(fù)方在數(shù)千年發(fā)展過(guò)程中，在保障人體和動(dòng)物機(jī)體健康的過(guò)程中發(fā)揮了不可替代的作用，但新藥復(fù)方的研發(fā)相對(duì)比較緩慢。中藥復(fù)方除了有能夠治療慢性疾病、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)外，近年來(lái)相關(guān)學(xué)者提出中藥思維模式的研究，Lu等指出中藥模式可能導(dǎo)致革新^[2]。本試驗(yàn)根據(jù)中藥復(fù)方的組方原則，選取多味中藥，制成4種復(fù)方制劑，研究各中藥復(fù)方的免疫增強(qiáng)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

蒲公英、山銀花、淡竹葉、山楂、連翹、黨參、生姜、紅芪、三七、甘草、桔梗、黃連、梔子、丹皮、黃芪、赤芍、玄參、知母、石膏、水牛角、生地、金銀花、野菊花、紫花地丁、紫背天葵、黃芩、黃藥子、白藥子、大黃、浙貝母、防風(fēng)、蟬蛻、郁金、樸硝、喜炎平、木藍(lán)，試驗(yàn)藥物均購(gòu)自江蘇泰州市同仁堂藥店。

1.2 試劑與儀器

刀豆蛋白A（ConA）、脂多糖（LPS）、瑞氏染液、細(xì)胞培養(yǎng)板、小鼠淋巴細(xì)胞分離液、RPMI 1640液體培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液、噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、苯酚紅、酶標(biāo)條、水解乳蛋白、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、無(wú)菌脫纖維羊血等購(gòu)自江蘇揚(yáng)州科能生物科技有限公司；一氧化氮（NO）試劑盒、一氧化氮合酶（NOS）分型試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）酶免疫分析試劑盒購(gòu)自上海橋杜商貿(mào)有限公司。U-2901型紫外、可見(jiàn)及近紅外分光光度計(jì)（日本HITACHI公司生產(chǎn)）、ELX800型酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek公司生產(chǎn)）、NU-4750E型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Nuaire公司生產(chǎn)）、RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)）、DW-20K調(diào)溫電熱器（上海蘇達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn)）。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

4～6周齡ICR小鼠，雌性各50%，購(gòu)于揚(yáng)州大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.4 組方原則

（1）八綱辨證：表里、寒熱、盛衰、虛實(shí)；（2）氣血津液辯證：氣行血，血以養(yǎng)津；（3）臟腑辯證：各臟及其腑；（4）三焦辯證：上焦、中焦、下焦；（5）因畜因地因時(shí)制宜：道法自然；（6）整體觀念：天人合一的思想；（7）陰陽(yáng)組方：易經(jīng)；（8）多種治法綜合應(yīng)用：寒熱、補(bǔ)瀉、上下、走守、升降、表里、潤(rùn)燥，根據(jù)以上原則將上述中藥組成復(fù)方1、復(fù)方2、復(fù)方3和復(fù)方4。

1.5 復(fù)方制劑

藥材與水比例1 g∶10mL過(guò)夜浸泡，武火煮沸后再文火保持微沸狀態(tài)2 h，過(guò)濾，再加入等量水提取，如此重復(fù)2次，合并濾液，各組方藥物均在冷凝回流條件提取下，提取液40～50 ℃ 濃縮為1 g生藥/mL，高壓蒸汽滅菌后4 ℃保存，備用。

1.6 脾臟指數(shù)和體重

試驗(yàn)小鼠平均隨機(jī)分為5組，試驗(yàn)組分別注射各復(fù)方制劑每只0.2 mL/d，連續(xù)腹腔注射14 d，對(duì)照組注射等量蒸餾水，脾臟指數(shù)計(jì)算公式：脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.7 4組復(fù)方對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

小鼠分組與處理同“1.6”節(jié)，連續(xù)注射14 d，不同的是在第4天各試驗(yàn)組注射0.2 mL 5%的綿羊紅細(xì)胞生理鹽水混懸液。試驗(yàn)方法根據(jù)參考文獻(xiàn)[3]，給藥后15 d乙醚麻醉5組小鼠，腹腔消毒后注射生長(zhǎng)液3 mL，后輕揉腹部5 min，接著注射1 mL 5%雞紅細(xì)胞，輕揉10 min后吸取腹腔液滴于載玻片，置濕盒內(nèi)在37 ℃恒溫孵育30～45 min，生理鹽水沖去浮著的細(xì)胞后常規(guī)瑞氏染色。根據(jù)公式計(jì)算吞噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)：吞噬率=吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬細(xì)胞數(shù)/100個(gè)吞噬細(xì)胞×100%；吞噬指數(shù)=被吞噬的紅細(xì)胞數(shù)/100個(gè)吞噬細(xì)胞×100%。

1.8 4組復(fù)方對(duì)小鼠溶血素和溶血空斑的影響

小鼠分組與處理同“1.6”節(jié)，溶血素測(cè)定見(jiàn)文獻(xiàn)[3]，給藥后15 d摘眼球取血，離心分離血清，用生理鹽水1 ∶100稀釋后取1 mL，與5%綿羊紅細(xì)胞混懸液 0.5 mL和10%補(bǔ)體 0.5 mL 混勻，37 ℃溫育30 min，冰水中止反應(yīng)，以不加補(bǔ)體的空白管作對(duì)照，取上清液測(cè)540 nm處的吸光度（D540 nm），作為血清中溶血素的指標(biāo)。endprint

溶血空斑測(cè)定參考文獻(xiàn)[4]，給藥后15 d斷頸處死小鼠，無(wú)菌采取脾臟，制取脾細(xì)胞懸液并調(diào)節(jié)濃度為5×106個(gè)/mL。取脾細(xì)胞混懸液0.5 mL加0.2%綿羊紅細(xì)胞混懸液和10%補(bǔ)體各0.5 mL，混勻，37 ℃溫育1 h，離心，以不加補(bǔ)體的空白管調(diào)零點(diǎn)。取上清液測(cè)540 nm處的吸光度（D540 nm），作為溶血空斑的指標(biāo)。

1.9 淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定

采用MTT比色法^[5]，小鼠斷頸處死，無(wú)菌取出脾臟，組織勻漿，加入淋巴細(xì)胞分離液，1 800 r/min，離心 25 min，吸取中間環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞，Hanks液反復(fù)洗3次，用RPMI 1640營(yíng)養(yǎng)液稀釋成5×106個(gè)/mL細(xì)胞的淋巴細(xì)胞懸液。細(xì)胞培養(yǎng)板中依次對(duì)照組（A）、復(fù)方1（B）、復(fù)方2（C）、復(fù)方3（D）、復(fù)方4（E）、RPMI 1640（F），1、2、3、4列加入ConA（終濃度為 5 μg/mL），5、6、7、8列加入LPS（終濃度為10 μg/mL），9、10、11、12列加入RPMI 1640，每孔各加100 μL。37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)68 h，加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸取上清液加入100 μL DMSO，微量振蕩器混勻，使其顏色變澄清，酶聯(lián)免疫儀檢測(cè)570 nm處的吸光度（D570 nm），作為淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo)。

1.10 血清中NO、NOS、NK細(xì)胞測(cè)定

采用上述相關(guān)試劑盒測(cè)定。

1.11 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS軟件進(jìn)行Duncans多重分析，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 脾臟指數(shù)和體質(zhì)量變化

由表1可知，與對(duì)照組相比，4種中藥復(fù)方對(duì)小鼠的體質(zhì)量影響差異不顯著，復(fù)方3對(duì)小鼠的脾臟指數(shù)影響差異不顯著，復(fù)方1、復(fù)方2、復(fù)方4均對(duì)小鼠的脾臟指數(shù)有顯著影響。

疫器官質(zhì)量的增加可以在一定程度上反映機(jī)體的免疫能力^[6]，本研究中除復(fù)方3外，其余3種復(fù)方均能顯著增強(qiáng)小鼠的脾臟指數(shù)，但對(duì)小鼠的體質(zhì)量增加表現(xiàn)不明顯，與付秀華等報(bào)道的中藥可顯著增加小鼠脾臟指數(shù)，對(duì)增加體質(zhì)量作用不顯著^[7-8]一致。單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的重要指標(biāo)之一^[9]，巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)可以反映腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的強(qiáng)弱，本研究中4種中藥復(fù)方都能夠增強(qiáng)小鼠的非特異性免疫。當(dāng)雞紅細(xì)胞作為外來(lái)抗原被注射入小鼠體內(nèi)時(shí)，小鼠機(jī)體特異性免疫系統(tǒng)則產(chǎn)生針對(duì)此種抗原的特異性抗體，在體外再次利用抗原與抗體在補(bǔ)體的作用下反應(yīng)，通過(guò)吸光值的大小反映機(jī)體的溶血素水平高低，得出4種復(fù)方對(duì)機(jī)體的特異性免疫水平影響。結(jié)果表明，4種復(fù)方均能夠顯著增強(qiáng)機(jī)體的溶血素水平，顯著增強(qiáng)特異性免疫能力。綿羊細(xì)胞溶解后即產(chǎn)生溶血空斑，溶血空斑可反映B細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)^[10]，本研究中除復(fù)方1外，其余3種復(fù)方對(duì)溶血空斑的形成均有顯著作用。MTT法作為淋巴細(xì)胞增殖常用方法，本試驗(yàn)采用此法測(cè)得經(jīng)ConA誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)中復(fù)方3差異顯著，經(jīng)LPS誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)中復(fù)方4差異顯著，結(jié)果表明，不同的誘導(dǎo)劑在淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)中產(chǎn)生不同的作用。本試驗(yàn)中NO、NOS和NK細(xì)胞均采用的是商業(yè)性試劑盒測(cè)試，測(cè)試結(jié)果，4組復(fù)方作用結(jié)果NOS差異均不顯著，復(fù)方4顯著提高血清中NO，NK細(xì)胞差異較顯著，原因可能是受給藥劑量、藥材產(chǎn)地等的影響，據(jù)報(bào)道藥劑量、藥材產(chǎn)地會(huì)影響藥效，劉盛等在研究不同種質(zhì)板藍(lán)根和大青葉時(shí)，各種質(zhì)藥材樣品抗病毒活性的有無(wú)及強(qiáng)度有明顯差異^[11]，王遠(yuǎn)閣通過(guò)試驗(yàn)4種中藥多糖刺激細(xì)胞表達(dá)NOS并產(chǎn)生NO有一定的量效關(guān)系^[12]。綜上所述，復(fù)方4在4種中藥復(fù)方中的免疫增強(qiáng)作用最強(qiáng)。

陰陽(yáng)和五行是傳統(tǒng)中藥復(fù)方制劑治療和預(yù)防疾病的核心依據(jù)^[13]，被用于解釋世界的變化，本研究中的重要復(fù)方在選方組方時(shí)嚴(yán)格遵循中醫(yī)的理論，所以取得了良好的增強(qiáng)小鼠免疫的效果。也有研究表明，復(fù)方中藥在治療疾病過(guò)程中，重要作用之一是眾多的藥材在體內(nèi)外使得機(jī)體的氧化應(yīng)激和氧化還原處于平衡^[14]，本試驗(yàn)4種中藥復(fù)方對(duì)機(jī)體的氧化應(yīng)激和氧化還原之間平衡的機(jī)理還有待于進(jìn)一步深入研究。

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溶血空斑測(cè)定參考文獻(xiàn)[4]，給藥后15 d斷頸處死小鼠，無(wú)菌采取脾臟，制取脾細(xì)胞懸液并調(diào)節(jié)濃度為5×106個(gè)/mL。取脾細(xì)胞混懸液0.5 mL加0.2%綿羊紅細(xì)胞混懸液和10%補(bǔ)體各0.5 mL，混勻，37 ℃溫育1 h，離心，以不加補(bǔ)體的空白管調(diào)零點(diǎn)。取上清液測(cè)540 nm處的吸光度（D540 nm），作為溶血空斑的指標(biāo)。

1.9 淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定

采用MTT比色法^[5]，小鼠斷頸處死，無(wú)菌取出脾臟，組織勻漿，加入淋巴細(xì)胞分離液，1 800 r/min，離心 25 min，吸取中間環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞，Hanks液反復(fù)洗3次，用RPMI 1640營(yíng)養(yǎng)液稀釋成5×106個(gè)/mL細(xì)胞的淋巴細(xì)胞懸液。細(xì)胞培養(yǎng)板中依次對(duì)照組（A）、復(fù)方1（B）、復(fù)方2（C）、復(fù)方3（D）、復(fù)方4（E）、RPMI 1640（F），1、2、3、4列加入ConA（終濃度為 5 μg/mL），5、6、7、8列加入LPS（終濃度為10 μg/mL），9、10、11、12列加入RPMI 1640，每孔各加100 μL。37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)68 h，加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸取上清液加入100 μL DMSO，微量振蕩器混勻，使其顏色變澄清，酶聯(lián)免疫儀檢測(cè)570 nm處的吸光度（D570 nm），作為淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo)。

1.10 血清中NO、NOS、NK細(xì)胞測(cè)定

采用上述相關(guān)試劑盒測(cè)定。

1.11 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS軟件進(jìn)行Duncans多重分析，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 脾臟指數(shù)和體質(zhì)量變化

由表1可知，與對(duì)照組相比，4種中藥復(fù)方對(duì)小鼠的體質(zhì)量影響差異不顯著，復(fù)方3對(duì)小鼠的脾臟指數(shù)影響差異不顯著，復(fù)方1、復(fù)方2、復(fù)方4均對(duì)小鼠的脾臟指數(shù)有顯著影響。

疫器官質(zhì)量的增加可以在一定程度上反映機(jī)體的免疫能力^[6]，本研究中除復(fù)方3外，其余3種復(fù)方均能顯著增強(qiáng)小鼠的脾臟指數(shù)，但對(duì)小鼠的體質(zhì)量增加表現(xiàn)不明顯，與付秀華等報(bào)道的中藥可顯著增加小鼠脾臟指數(shù)，對(duì)增加體質(zhì)量作用不顯著^[7-8]一致。單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的重要指標(biāo)之一^[9]，巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)可以反映腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的強(qiáng)弱，本研究中4種中藥復(fù)方都能夠增強(qiáng)小鼠的非特異性免疫。當(dāng)雞紅細(xì)胞作為外來(lái)抗原被注射入小鼠體內(nèi)時(shí)，小鼠機(jī)體特異性免疫系統(tǒng)則產(chǎn)生針對(duì)此種抗原的特異性抗體，在體外再次利用抗原與抗體在補(bǔ)體的作用下反應(yīng)，通過(guò)吸光值的大小反映機(jī)體的溶血素水平高低，得出4種復(fù)方對(duì)機(jī)體的特異性免疫水平影響。結(jié)果表明，4種復(fù)方均能夠顯著增強(qiáng)機(jī)體的溶血素水平，顯著增強(qiáng)特異性免疫能力。綿羊細(xì)胞溶解后即產(chǎn)生溶血空斑，溶血空斑可反映B細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)^[10]，本研究中除復(fù)方1外，其余3種復(fù)方對(duì)溶血空斑的形成均有顯著作用。MTT法作為淋巴細(xì)胞增殖常用方法，本試驗(yàn)采用此法測(cè)得經(jīng)ConA誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)中復(fù)方3差異顯著，經(jīng)LPS誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)中復(fù)方4差異顯著，結(jié)果表明，不同的誘導(dǎo)劑在淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)中產(chǎn)生不同的作用。本試驗(yàn)中NO、NOS和NK細(xì)胞均采用的是商業(yè)性試劑盒測(cè)試，測(cè)試結(jié)果，4組復(fù)方作用結(jié)果NOS差異均不顯著，復(fù)方4顯著提高血清中NO，NK細(xì)胞差異較顯著，原因可能是受給藥劑量、藥材產(chǎn)地等的影響，據(jù)報(bào)道藥劑量、藥材產(chǎn)地會(huì)影響藥效，劉盛等在研究不同種質(zhì)板藍(lán)根和大青葉時(shí)，各種質(zhì)藥材樣品抗病毒活性的有無(wú)及強(qiáng)度有明顯差異^[11]，王遠(yuǎn)閣通過(guò)試驗(yàn)4種中藥多糖刺激細(xì)胞表達(dá)NOS并產(chǎn)生NO有一定的量效關(guān)系^[12]。綜上所述，復(fù)方4在4種中藥復(fù)方中的免疫增強(qiáng)作用最強(qiáng)。

陰陽(yáng)和五行是傳統(tǒng)中藥復(fù)方制劑治療和預(yù)防疾病的核心依據(jù)^[13]，被用于解釋世界的變化，本研究中的重要復(fù)方在選方組方時(shí)嚴(yán)格遵循中醫(yī)的理論，所以取得了良好的增強(qiáng)小鼠免疫的效果。也有研究表明，復(fù)方中藥在治療疾病過(guò)程中，重要作用之一是眾多的藥材在體內(nèi)外使得機(jī)體的氧化應(yīng)激和氧化還原處于平衡^[14]，本試驗(yàn)4種中藥復(fù)方對(duì)機(jī)體的氧化應(yīng)激和氧化還原之間平衡的機(jī)理還有待于進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)：

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[7]付秀華. 中草藥組方對(duì)小鼠免疫功能的影響[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[8]劉翠艷. 獸醫(yī)中藥免疫增強(qiáng)劑的篩選試驗(yàn)及其藥理學(xué)研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

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溶血空斑測(cè)定參考文獻(xiàn)[4]，給藥后15 d斷頸處死小鼠，無(wú)菌采取脾臟，制取脾細(xì)胞懸液并調(diào)節(jié)濃度為5×106個(gè)/mL。取脾細(xì)胞混懸液0.5 mL加0.2%綿羊紅細(xì)胞混懸液和10%補(bǔ)體各0.5 mL，混勻，37 ℃溫育1 h，離心，以不加補(bǔ)體的空白管調(diào)零點(diǎn)。取上清液測(cè)540 nm處的吸光度（D540 nm），作為溶血空斑的指標(biāo)。

1.9 淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定

采用MTT比色法^[5]，小鼠斷頸處死，無(wú)菌取出脾臟，組織勻漿，加入淋巴細(xì)胞分離液，1 800 r/min，離心 25 min，吸取中間環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞，Hanks液反復(fù)洗3次，用RPMI 1640營(yíng)養(yǎng)液稀釋成5×106個(gè)/mL細(xì)胞的淋巴細(xì)胞懸液。細(xì)胞培養(yǎng)板中依次對(duì)照組（A）、復(fù)方1（B）、復(fù)方2（C）、復(fù)方3（D）、復(fù)方4（E）、RPMI 1640（F），1、2、3、4列加入ConA（終濃度為 5 μg/mL），5、6、7、8列加入LPS（終濃度為10 μg/mL），9、10、11、12列加入RPMI 1640，每孔各加100 μL。37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)68 h，加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸取上清液加入100 μL DMSO，微量振蕩器混勻，使其顏色變澄清，酶聯(lián)免疫儀檢測(cè)570 nm處的吸光度（D570 nm），作為淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo)。

1.10 血清中NO、NOS、NK細(xì)胞測(cè)定

采用上述相關(guān)試劑盒測(cè)定。

1.11 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS軟件進(jìn)行Duncans多重分析，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 脾臟指數(shù)和體質(zhì)量變化

由表1可知，與對(duì)照組相比，4種中藥復(fù)方對(duì)小鼠的體質(zhì)量影響差異不顯著，復(fù)方3對(duì)小鼠的脾臟指數(shù)影響差異不顯著，復(fù)方1、復(fù)方2、復(fù)方4均對(duì)小鼠的脾臟指數(shù)有顯著影響。

疫器官質(zhì)量的增加可以在一定程度上反映機(jī)體的免疫能力^[6]，本研究中除復(fù)方3外，其余3種復(fù)方均能顯著增強(qiáng)小鼠的脾臟指數(shù)，但對(duì)小鼠的體質(zhì)量增加表現(xiàn)不明顯，與付秀華等報(bào)道的中藥可顯著增加小鼠脾臟指數(shù)，對(duì)增加體質(zhì)量作用不顯著^[7-8]一致。單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的重要指標(biāo)之一^[9]，巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)可以反映腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的強(qiáng)弱，本研究中4種中藥復(fù)方都能夠增強(qiáng)小鼠的非特異性免疫。當(dāng)雞紅細(xì)胞作為外來(lái)抗原被注射入小鼠體內(nèi)時(shí)，小鼠機(jī)體特異性免疫系統(tǒng)則產(chǎn)生針對(duì)此種抗原的特異性抗體，在體外再次利用抗原與抗體在補(bǔ)體的作用下反應(yīng)，通過(guò)吸光值的大小反映機(jī)體的溶血素水平高低，得出4種復(fù)方對(duì)機(jī)體的特異性免疫水平影響。結(jié)果表明，4種復(fù)方均能夠顯著增強(qiáng)機(jī)體的溶血素水平，顯著增強(qiáng)特異性免疫能力。綿羊細(xì)胞溶解后即產(chǎn)生溶血空斑，溶血空斑可反映B細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)^[10]，本研究中除復(fù)方1外，其余3種復(fù)方對(duì)溶血空斑的形成均有顯著作用。MTT法作為淋巴細(xì)胞增殖常用方法，本試驗(yàn)采用此法測(cè)得經(jīng)ConA誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)中復(fù)方3差異顯著，經(jīng)LPS誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)中復(fù)方4差異顯著，結(jié)果表明，不同的誘導(dǎo)劑在淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)中產(chǎn)生不同的作用。本試驗(yàn)中NO、NOS和NK細(xì)胞均采用的是商業(yè)性試劑盒測(cè)試，測(cè)試結(jié)果，4組復(fù)方作用結(jié)果NOS差異均不顯著，復(fù)方4顯著提高血清中NO，NK細(xì)胞差異較顯著，原因可能是受給藥劑量、藥材產(chǎn)地等的影響，據(jù)報(bào)道藥劑量、藥材產(chǎn)地會(huì)影響藥效，劉盛等在研究不同種質(zhì)板藍(lán)根和大青葉時(shí)，各種質(zhì)藥材樣品抗病毒活性的有無(wú)及強(qiáng)度有明顯差異^[11]，王遠(yuǎn)閣通過(guò)試驗(yàn)4種中藥多糖刺激細(xì)胞表達(dá)NOS并產(chǎn)生NO有一定的量效關(guān)系^[12]。綜上所述，復(fù)方4在4種中藥復(fù)方中的免疫增強(qiáng)作用最強(qiáng)。

陰陽(yáng)和五行是傳統(tǒng)中藥復(fù)方制劑治療和預(yù)防疾病的核心依據(jù)^[13]，被用于解釋世界的變化，本研究中的重要復(fù)方在選方組方時(shí)嚴(yán)格遵循中醫(yī)的理論，所以取得了良好的增強(qiáng)小鼠免疫的效果。也有研究表明，復(fù)方中藥在治療疾病過(guò)程中，重要作用之一是眾多的藥材在體內(nèi)外使得機(jī)體的氧化應(yīng)激和氧化還原處于平衡^[14]，本試驗(yàn)4種中藥復(fù)方對(duì)機(jī)體的氧化應(yīng)激和氧化還原之間平衡的機(jī)理還有待于進(jìn)一步深入研究。

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[7]付秀華. 中草藥組方對(duì)小鼠免疫功能的影響[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[8]劉翠艷. 獸醫(yī)中藥免疫增強(qiáng)劑的篩選試驗(yàn)及其藥理學(xué)研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

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[12]王遠(yuǎn)閣. 4種中藥多糖免疫增強(qiáng)作用的研究[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

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