曹思源+王芳+丁國華+李佳琦+高歌+安夢妍

摘 要：以中華水韭為試驗材料，用200μmol·L-1的氯化鎘溶液和2g·L-1的硝酸鉛分別對其進(jìn)行脅迫處理，采用cDNA-AFLP技術(shù)分離差異表達(dá)基因，通過Blast（The Basic Local Alignment Search Tool）同源性比對分析基因功能，為尋找耐重金屬脅迫相關(guān)基因和揭示水韭對環(huán)境變化響應(yīng)的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。試驗結(jié)果如下：共有15條差異條帶被成功克隆和測序，其中13條差異片段可以在數(shù)據(jù)庫找到與之同源的序列。鎘脅迫差異表達(dá)TDF9與ABC型（ATP-binding cassette）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白C亞族基因有84%同源性。鉛脅迫差異表達(dá)TDF4和TDF7與環(huán)形鋅指蛋白（RING Zinc Finger Protein）有75%同源性。這些基因的發(fā)現(xiàn)為揭示水韭對環(huán)境變化敏感的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：中華水韭；重金屬脅迫；鉛；鎘；cDNA-AFLP

中圖分類號 Q948.116 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）18-22-03

當(dāng)前土壤和水域的重金屬污染日益嚴(yán)重，為此國家于2013年啟動了重金屬污染耕地修復(fù)的試點(diǎn)[1]。重金屬（主要是鎘、鉛、砷、汞、鉻等）不僅嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育，而且通過糧食及蔬菜進(jìn)入人體并積累，威脅人類身體健康。其中鎘和鉛毒性最強(qiáng)，污染也最嚴(yán)重[2]。

中華水韭（Isoetes sinensis Palmer），小型葉蕨類，為水韭科水韭屬（孑遺屬）沼澤指示植物，因生存環(huán)境的變遷和生存區(qū)域的減少，已成為瀕危物種，被列為國家一級重點(diǎn)保護(hù)野生植物[3]。對中華水韭生境調(diào)查發(fā)現(xiàn)，土壤中鎘和鉛的含量嚴(yán)重超標(biāo)[4]。研究表明，中華水韭對除草劑[5]和重金屬鉛有很高的耐受性，因此，研究“植物活化石”中華水韭對重金屬脅迫的響應(yīng)，特別是在基因表達(dá)方面的響應(yīng)，對于揭示中華水韭對重金屬脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制及植物響應(yīng)逆境的原始反應(yīng)機(jī)制有著重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料 試材中華水韭為我院蕨類研究室繁殖培養(yǎng)的植株。于2011年4月選取長勢整齊一致的中華水韭植株，用水沖洗去除根部泥土，毎3株為一組放入裝有蒸餾水的容器中重新培養(yǎng)至長出新根。待根生長至3cm長時，倒掉蒸餾水，添加等體積的Hoagland完全營養(yǎng)液，每7d更換一次營養(yǎng)液，約30d后植株恢復(fù)長勢進(jìn)行重金屬脅迫處理。

1.2 重金屬脅迫處理 處理前倒掉營養(yǎng)液，加等量去離子水。2d后倒掉去離子水，對照組仍加去離子水，處理組分別加等量200μmol·L-1的氯化鎘溶液和2g·L-1的硝酸鉛。自脅迫處理開始，分別于第6h、24h、72h煎取中部長勢良好葉片迅速放到液氮中冷凍，并保存在-80℃冰箱中，用于RNA提取。

1.3 cDNA-AFLP分析 RNA提取采用天根生化試劑（北京）有限公司的植物總RNA提取試劑盒，雙鏈cDNA的合成采用寶生物公司的cDNA Synthesis Kit（M-MLV Version）試劑盒，紫外分光光度計測定雙鏈cDNA濃度，并調(diào)整各樣品濃度為80ng·μL-1。AFLP流程及反應(yīng)體系參照黃河等[6]的方法進(jìn)行，具體操作如下：（1）酶切：用EcoR I和Mse I對反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA進(jìn)行雙酶切。（2）連接：將EcoR I-adaptor、Mse I-adaptor接頭用T4 DNA Ligase連接。（3）預(yù)擴(kuò)增：用EcoR I-00和Mse I-00為引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。（4）選擇性擴(kuò)增：通用引物（E1～8，M1～8，共64個引物組合）進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。（5）聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.4 差異表達(dá)片段的回收、克隆、測序及同源性分析 將聚丙烯酰胺凝膠上差異條帶用滅菌的鋒利刀片切下，煮沸法回收DNA，以回收產(chǎn)物為模板，用對應(yīng)的引物組合重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件跟預(yù)擴(kuò)增體系相同。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并送上海生工生物工程公司測序。測序結(jié)果提交NCBI進(jìn)行Blastx同源性比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達(dá)條帶的統(tǒng)計和分類 根據(jù)鎘和鉛脅迫的cDNA-AFLP電泳圖將差異表達(dá)條帶進(jìn)行統(tǒng)計并分類，大致分成4類：（1）I類型條帶：條帶在正常情況和整個重金屬脅迫的過程都存在?；虻谋磉_(dá)水平在正常情況和整個重金屬脅迫的過程中沒有任何改變。（2）II類型條帶：在正常情況和重金屬脅迫初期存在，隨著重金屬脅迫強(qiáng)度的加大，基因的表達(dá)量減弱或消失隨后又增強(qiáng)。（3）III類型條帶：在正常情況下沒有或表達(dá)很弱，在重金屬脅迫的過程中開始表達(dá)或表達(dá)量加強(qiáng)。（4）IV類型條帶：在正常情況下存在，在重金屬脅迫過程中條帶消失，不再表達(dá)。

將鉛和鎘脅迫的差異條帶進(jìn)行統(tǒng)計，總共統(tǒng)計出184條差異表達(dá)TDFs。其中，I類型差異表達(dá)TDFs為24條，占總數(shù)的13%；II類型差異表達(dá)TDFs為24條，占總數(shù)的13%；III類型差異表達(dá)TDFs為109條，占總數(shù)的59%；IV類型差異表達(dá)TDFs為27條，占總數(shù)的15%。

2.2 差異表達(dá)條帶的測序和同源性分析 鉛脅迫和鎘脅迫的聚丙酰胺凝膠中共挑選出15條差異條帶進(jìn)行回收，條帶都可以被選擇性擴(kuò)增引物重新擴(kuò)增，這些條帶分布主要在500～250bp范圍內(nèi)。將回收的15條差異片段TDFs進(jìn)行測序，測序后的差異條帶與純化后的片段長度一致，試驗中所用的接頭序列與測序片段兩端序列一致，表明序列測定結(jié)果可靠。將15條差異條帶測序結(jié)果用NCBI中的Blastn和Blastx進(jìn)行同源序列的比對，其同源性比對結(jié)果見表1。

表1 差異表達(dá)基因片段在NCBI進(jìn)行的Blast比對

[TDFs＼&Size（bp）＼&Sequence similarity＼&E value＼&TDF1＼&604＼&Hypothetical protein SELMODRAFT_177510＼&a9e-66＼&TDF2＼&402＼&Triticum aestivum cDNA，clone： WT003_G01，cultivar： Chinese Spring＼&1e-70＼&TDF3＼&316＼&No match＼&＼&TDF4＼&274＼&V-type proton ATPase subunit G-like isoform 1＼&a2e-09＼&zinc finger RING-type protein＼&a9e-09＼&TDF5＼&131＼&No match＼&＼&TDF6＼&168＼&Isoetes engelmannii 18S ribosomal RNA gene，partial sequence＼&4e-47＼&TDF7＼&205＼&PREDICTED： V-type proton ATPase subunit G-like isoform 1 [Cucumis sativus]＼&a7e-10＼&zinc finger RING-type protein [Cucumis sativus]＼&a3e-09＼&TDF8 ＼&177＼&hypothetical protein [Pseudomonas sp.PAMC 26793]＼&a1e-12＼&TDF9＼&398＼&Medicago truncatula ABC transporter C family member （MTR_8g040620） mRNA，complete cds＼&7e-34＼&TDF10＼&373＼&No match＼&＼&TDF11＼&285＼&ABC transporter B family protein＼&a2.0＼&putative 4-alpha-glucanotransferase [Prevotella disiens]＼&a7.1＼&TDF12＼&371＼&pentatricopeptide repeat-containing protein At1g11290-like [Vitis vinifera]＼&a3e-23＼&TDF13endprint

＼&80＼&retrotransposon protein，putative，unclassified [Oryza sativa Japonica Group]＼&a2.8＼&TDF14＼&410＼&RecName：Full=Transposon TX1 uncharacterized 149 kDa protein； AltName： Full=ORF 2＼&9e-05＼& retrotransposon protein，putative，unclassified [Oryza sativa Japonica Group]＼&a1e-07＼&putative non-LTR retroelement reverse transcriptase [Oryza sativa Japonica Group]＼&a1e-07＼&TDF15 ＼&336＼&Predicted RNA-binding protein homologous to eukaryotic snRNP [Ruminococcus obeum A2-162]＼&a3.6＼&]

注：a表示進(jìn)行blastx比對得到的，其余是進(jìn)行blastn比對得到的；TDF1-8為鉛脅迫差異表達(dá)基因，TDF 9-15為鎘脅迫差異表達(dá)基因。

在測序成功的差異片段中，通過blastx同源性比對，鉛脅迫的TDF4和TDF7與V型ATP酶G亞基和環(huán)形鋅指蛋白有均75%的同源性。鎘脅迫的TDF11與ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族B亞族和假定的4-α葡聚糖有同源性。鎘脅迫的TDF12與三角狀五肽重復(fù)蛋白有同源性。鎘脅迫的TDF14與反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的蛋白質(zhì)有同源性。通過blastn同源性比對，鉛脅迫的TDF6基因與水韭的18S核糖體部RNA基因有100%的同源性。鎘脅迫的TDF9基因與ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中C亞族的基因有84%的同源性。

3 結(jié)論與討論

本文分離得到的TDF4、TDF7、TDF9均比對出同源性在75%以上的基因，這些基因與重金屬脅迫相關(guān)。其中，鎘脅迫的TDF9與ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族C亞族基因有84%同源性。從cDNA-AFLP電泳圖觀察，屬第Ⅲ類型條帶。該基因在鎘脅迫之前沒有出現(xiàn)，在鎘脅迫以后開始表達(dá)。ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette transporters），全稱為腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)器，在其上含有與ATP結(jié)合的框架，通過與ATP的解離和結(jié)合來調(diào)節(jié)物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸[7]。ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白大部分分布在真核細(xì)胞的細(xì)胞膜上，少部分分布在線粒體、過氧化物、液泡膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物的生命活動有重要的作用，一是將細(xì)胞內(nèi)外的異源性化合物和有毒物質(zhì)進(jìn)行隔離或排出細(xì)胞外；二是將植物的次生代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中或區(qū)室化；三是轉(zhuǎn)運(yùn)植物生長發(fā)育中所需要的信號分子。ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族C亞族（ABCC）是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的一個，是ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白加上了一個疏水性N端，一般相關(guān)報道是以MRP（multidrug resistance-associated protein）命名[8]。MRP亞族全稱為廣譜抗藥性相關(guān)蛋白亞家族，主要存在液泡膜上，在細(xì)胞質(zhì)膜上也有存在，其主要功能是將有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中，并將有毒物質(zhì)進(jìn)行螯合，起到對細(xì)胞的解毒作用。有研究證明，MRP對受重金屬鎘脅迫的植株有解毒作用[9]。MRP可以充當(dāng)鎘泵，參與跨液泡膜轉(zhuǎn)運(yùn)Cd2+螯合物或GS-Cd復(fù)合體[10]。有研究表明，大麥在受到200μM鎘脅迫下，有一個與AtMRP3具有同源性的基因上調(diào)表達(dá)[11]。還有研究發(fā)現(xiàn)，煙草在受到鎘脅迫的過程中，液泡膜上的AtMRP7基因過量表達(dá)，產(chǎn)生的MRP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將鎘轉(zhuǎn)運(yùn)到葉片的液泡中，提高液泡中鎘的含量，從而降低鎘對植物的毒害[12]。TDF9就是鎘脅迫所產(chǎn)生差異表達(dá)的基因，而且是在鎘脅迫后開始表達(dá)的，通過以上研究者的研究，可以推測中華水韭在受到鎘脅迫時，產(chǎn)生了對鎘響應(yīng)的基因TDF9，其表達(dá)產(chǎn)物的作用是否與MRP一致，還需進(jìn)一步的試驗加以驗證。

鉛脅迫的TDF4和TDF7與環(huán)形鋅指蛋白（Ring Zinc Finger Protein）有75%同源性。從cDNA-AFLP電泳圖觀察，也屬于第Ⅲ類型的條帶。該基因在鉛脅迫之前沒有出現(xiàn)，在鉛脅迫以后開始表達(dá)。環(huán)形鋅指蛋白是一個具有泛素連接酶作用的結(jié)構(gòu)，又叫E3泛素連接酶[13]。它與泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2共同作用，將泛素分子標(biāo)記的靶蛋白進(jìn)行特異性修飾。這一作用機(jī)理可以對細(xì)胞周期、增殖、凋亡、分化、轉(zhuǎn)移、基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號傳遞、DNA損傷修等生命活動起到調(diào)控。最新研究表明：擬南芥環(huán)形鋅指蛋白LsRZF1基因可以降低脫落酸的含量及滲透脅迫，并能控制脯氨酸的代謝，從而增強(qiáng)植物對逆境環(huán)境的適應(yīng)[14]。

目前在國際上，對中華水韭的生理生化過程及形態(tài)發(fā)育研究已取得較多成果，但分子機(jī)理方面的研究成果較少。以上這些差異表達(dá)基因的發(fā)現(xiàn)將為揭示中華水韭對環(huán)境變化敏感的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)編：張宏民）endprint