湯薇等

摘要：基于血紅素（Hemin）與G四聯(lián)體（G4）所形成模擬酶的催化作用，結(jié)合等溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)（IEXPAR），建立了特定序列DNA的顯色檢測(cè)方法。目標(biāo)DNA引發(fā)IEXPAR，通過(guò)設(shè)計(jì)模板序列，IEXPAR產(chǎn)生大量富含鳥(niǎo)嘌呤的單鏈DNA，在K+存在時(shí)，該單鏈DNA可形成G4結(jié)構(gòu)，G4可以與Hemin結(jié)合形成具有過(guò)氧化物酶活性的模擬酶（HeminG4），HeminG4催化H2O2氧化2，2聯(lián)氮二（3乙基苯并噻唑6磺酸）二銨鹽 （ABTS），使體系顏色發(fā)生變化，反應(yīng)產(chǎn)物最大吸收波長(zhǎng)為421 nm。對(duì)顯色反應(yīng)體系中的實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，包括Hemin濃度、ABTS濃度、H2O2濃度、IEXPAR時(shí)間和顯色反應(yīng)時(shí)間。在最佳條件下，所建立的體系可以簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)0.1～10 nmol/L的目標(biāo)DNA分子，且本方法能夠很好地區(qū)分單個(gè)堿基的差別，具有良好的特異性。

關(guān)鍵詞：特定序列DNA的檢測(cè)； 等溫指數(shù)擴(kuò)增（IEXPAR）； HeminG4模擬酶； 顯色分析

1引言

核酸擴(kuò)增是實(shí)現(xiàn)高靈敏度檢測(cè)核酸的重要手段。目前常用的核酸擴(kuò)增技術(shù)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction， PCR），但PCR需要精確的熱循環(huán)和嚴(yán)格的反應(yīng)條件。近年來(lái)，核酸的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)得到了迅速發(fā)展[1]。等溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)（Isothermal exponential amplification reaction，IEXPAR）是Galas等建立的一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)[2]。結(jié)合DNA聚合酶催化的延伸反應(yīng)及切刻內(nèi)切酶的剪切作用，IEXPAR可以在等溫條件下，短時(shí)間內(nèi)對(duì)目標(biāo)核酸分子擴(kuò)增106～109倍。該技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快速的顯著優(yōu)點(diǎn)，其擴(kuò)增倍數(shù)可與PCR媲美。目前IEXPAR已廣泛用于特定序列DNA分析[3]、病毒基因鑒定[4，5]、microRNA測(cè)定[6，7]以及轉(zhuǎn)錄因子分析[8]。但基于IEXPAR的核酸分析多采用實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法，需要昂貴的實(shí)時(shí)熒光定量PCR等儀器。

在K+存在時(shí)，富含鳥(niǎo)嘌呤的單鏈DNA（G4DNA）通過(guò)分子內(nèi)氫鍵的相互作用可折疊形成穩(wěn)定的G四聯(lián)體結(jié)構(gòu)（G4）[9～11]，G4可與氯高鐵血紅素（Hemin）結(jié)合，形成具有過(guò)氧化物酶活性的模擬酶（HeminG4）[12]，HeminG4可以催化H2O2與2，2聯(lián)氮二（3乙基苯并噻唑6磺酸）二銨鹽（ABTS）的氧化反應(yīng)，使體系顏色發(fā)生變化，并在421 nm產(chǎn)生最大吸收。本研究通過(guò)設(shè)計(jì)IEXPAR反應(yīng)模板，產(chǎn)生G4DNA，利用HeminG4模擬酶的催化作用，結(jié)合等溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)，建立了一種廉價(jià)、簡(jiǎn)便的顯色法檢測(cè)特定序列DNA的新方法。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

3結(jié)果與討論

3.1等溫指數(shù)擴(kuò)增及顯色法檢測(cè)DNA的原理

等溫指數(shù)擴(kuò)增及顯色法檢測(cè)DNA的原理如圖1所示，首先根據(jù)檢測(cè)的TargetDNA及G4DNA 的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增模板Template 1和Template 2。Template 1的3′端序列與TargetDNA序列互補(bǔ)，5′端序列與G4DNA序列互補(bǔ)，Template 2的3′端和5′端序列相同且與G4DNA完全互補(bǔ)。Template 1和Template 2中間都含有切刻內(nèi)切酶Nt.BstNBI特異性識(shí)別序列；在DNA聚合酶和dNTPs存在時(shí)，TargetDNA與Template 1的3′端序列雜交， 并進(jìn)行延伸反應(yīng)， 形成含有Nt.BstNBI特異性識(shí)別序列的雙鏈DNA，Nt.BstNBI將識(shí)別對(duì)應(yīng)的雙鏈序列，并從其后4個(gè)堿基處將DNA剪切，釋放出G4DNA；切口處的DNA繼續(xù)延伸并被剪切，釋放出更多的G4DNA，形成線性放大的機(jī)制。另外，釋放出的G4DNA與Template 2的3′端序列雜交，并在聚合酶作用下沿著Template 2延伸形成雙鏈DNA，Nt.BstNBI識(shí)別其特異性序列并將延伸反應(yīng)產(chǎn)生的DNA剪切，切口處DNA繼續(xù)延伸、被剪切，這樣不斷進(jìn)行剪切延伸剪切，形成指數(shù)擴(kuò)增機(jī)制，產(chǎn)生大量G4DNA。在K+存在時(shí)，G4DNA形成G4結(jié)構(gòu)，G4與Hemin結(jié)合形成具有過(guò)氧化物酶活性的模擬酶，該模擬酶可以催化ABTSH2O2體系發(fā)生氧化還原反應(yīng)， 并伴隨顏色變化， 反應(yīng)產(chǎn)物最大吸收波長(zhǎng)為421 nm。通過(guò)測(cè)定吸光度可靈敏地檢測(cè)TargetDNA。

3.2實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

3.2.1Hemin濃度優(yōu)化固定ABTS濃度為5.0 mmol/L，H2O2濃度為1.0 mmol/L，G4DNA為1 μmol/L，研究了不同濃度Hemin與G4DNA所形成的模擬酶對(duì)ABTSH2O2顯色體系吸光度的影響，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)Hemin濃度低于2.5 μmol/L時(shí)，體系的吸光度隨著Hemin濃度升高快速增加；當(dāng)Hemin濃度大于2.5 μmol/L時(shí)，吸光度隨著Hemin濃度增加的趨勢(shì)趨于平緩。同時(shí)，空白的吸光度隨著Hemin濃度升高逐漸增加。當(dāng)Hemin濃度等于2.5 μmol/L，G4DNA產(chǎn)生的吸光度與空白的差值達(dá)到最大值。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定DNA時(shí)， Hemin濃度選擇為2.5 μmol/L。

3.2.2ABTS濃度優(yōu)化選擇Hemin濃度為2.5 μmol/L，H2O2濃度為1.0 mmol/L，G4DNA為1 μmol/L，考察了ABTS濃度對(duì)模擬酶ABTSH2O2顯色體系吸光度的影響。由圖3可見(jiàn)，隨著ABTS濃度增大，G4DNA所產(chǎn)生的吸光度呈逐漸增長(zhǎng)趨勢(shì)； ABTS濃度高于5 mmol/L， 吸光度增加趨于平緩，同時(shí)，由于ABTS在421 nm產(chǎn)生微弱的吸收，空白吸光度也隨ABTS濃度的升高逐漸增加。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)中ABTS最佳濃度選擇5 mmol/L。

3.4檢測(cè)方法的特異性評(píng)價(jià)

為了評(píng)價(jià)所建立方法對(duì)檢測(cè)特定序列的TargetDNA的特異性，按照2.2.1節(jié)的方法，在相同條件下對(duì)10 pmol/L TargetDNA及分別含有1， 2和 3個(gè)突變堿基的Mutant DNA 1， Mutant DNA 2和Mutant DNA 3（序列見(jiàn)表1）同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，Mutant DNA 1， Mutant DNA 2和Mutant DNA 3對(duì)檢測(cè)10 pmol/L TargetDNA產(chǎn)生的干擾分別為6.3%， 1.3%和0.1%。表明本方法能夠很好地識(shí)別TargetDNA中單個(gè)堿基差別，對(duì)特定序列的TargetDNA測(cè)定具有良好的特異性。

4結(jié)論

建立了一種利用顯色法結(jié)合IEXPAR高靈敏、高特異性檢測(cè)DNA的新方法。利用雙擴(kuò)增模板模型，通過(guò)設(shè)計(jì)Template 1的3′端序列實(shí)現(xiàn)不同特定序列核酸（包括DNA和RNA）的分析檢測(cè)，同時(shí)Template 1的5′端序列和Template 2可以作為普遍適用的序列實(shí)現(xiàn)IEXPAR的顯色檢測(cè)；利用HeminG4模擬酶催化ABTSH2O2顯色反應(yīng)，只需簡(jiǎn)單的分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，降低了檢測(cè)的成本；本方法可以利用微孔板檢測(cè)系統(tǒng)（如酶標(biāo)儀）， 實(shí)現(xiàn)高通量的樣品分析。

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