徐明芳等

摘要：利用LTQ Orbitrap XL組合型傅立葉變換高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)分析了乳源蛋白主要組分肽指紋圖譜。對(duì)南方水牛乳與不同來(lái)源的乳清蛋白的氨基酸序列研究結(jié)果表明，乳清蛋白經(jīng)酶解后主要為α乳白蛋白（αLa）和β乳球蛋白（βLg）組分，乳清蛋白肽質(zhì)指紋譜的分析顯示水牛乳與荷斯坦奶乳清蛋白αLa氨基酸發(fā)生變異的比率明顯少于山羊奶乳清蛋白αLa，說(shuō)明荷斯坦奶αLa和水牛乳αLa的差異更小，同源性更強(qiáng)；而水牛乳βLg與荷斯坦乳βLg氨基酸發(fā)生變異的部位比率要多于山羊奶，水牛乳βLg與山羊奶同源性更強(qiáng)；乳源酪蛋白酶解后的肽段主要組分為αs1CN，βCN，κN，通過(guò)對(duì)水牛乳酪蛋白的氨基酸序列的差異性分析，不同品種的乳源酪蛋白的氨基酸序列明顯存在差異。與乳清蛋白相比，奶牛品種差異導(dǎo)致乳蛋白發(fā)生氨基酸差異現(xiàn)象更顯著，酪蛋白的氨基酸序列對(duì)比表明，水牛奶酪蛋白與山羊奶酪蛋白比與乳牛酪蛋白的差異更大。

關(guān)鍵詞：LTQ Orbitrap質(zhì)譜； 乳源蛋白； 酪蛋白； 乳清蛋白； 肽質(zhì)指紋譜； 差異性

1引言

動(dòng)物乳中蛋白質(zhì)主要由酪蛋白（αs1酪蛋白、αs2酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白） 、乳清蛋白（β乳球蛋白和 α乳白蛋白、免疫球蛋白、牛血清蛋白）組成，乳蛋白在體內(nèi)合成過(guò)程中經(jīng)過(guò)大量的遺傳變異和豐富的翻譯后修飾，并受到地域、品種、飼料、氣候諸多因素的影響，致使乳蛋白的合成及表達(dá)呈現(xiàn)出較大的差異[1]，乳蛋白的組成變得異常復(fù)雜。近年對(duì)乳及乳制品中蛋白質(zhì)組分的分析檢測(cè)已有報(bào)道[2，3]，且主要集中在乳蛋白組分分離及含量檢測(cè)，但分析和鑒定復(fù)雜體系中的蛋白組分精細(xì)結(jié)構(gòu)肽質(zhì)指紋譜的差異性還是一大挑戰(zhàn)[4]。二維線性離子阱高分辨靜電場(chǎng)組合質(zhì)譜儀（LTQ Orbitrap XL）具有非常高的靈敏度，能夠?qū)悠愤M(jìn)行快速掃描，分辨率60 K時(shí)， 掃描周期不超過(guò)1 s； 具有高達(dá)100 K的分辨能力，可直接從復(fù)雜樣品中快速、靈敏、可靠地檢測(cè)化合物，在各個(gè)領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。本研究將利用LTQOrbitrap液相色譜質(zhì)譜技術(shù)對(duì)南方水牛奶乳清蛋白的酶解肽段進(jìn)行分析，檢測(cè)各離子片段的相對(duì)分子質(zhì)量及氨基酸組成，使用Mascot軟件在數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，得出預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的氨基酸序列，再與Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行比對(duì)，得出蛋白源自種屬，并與乳牛奶酪蛋白和山羊奶酪蛋白相對(duì)應(yīng)組分的氨基酸序列比對(duì)，研究其氨基酸序列間的差異，從而揭示由于乳牛品種遺傳特性差異引起乳清蛋白差異變化的本質(zhì)規(guī)律，為不同條件下乳蛋白表達(dá)圖譜庫(kù)的建立及奶乳蛋白快速檢測(cè)尋找分子標(biāo)記提供技術(shù)手段，為乳品加工保存條件的優(yōu)選及乳源蛋白不同組分的生物活性肽的研究提供理論依據(jù)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器、試劑與材料

LTQ Orbitrap XL質(zhì)譜儀（Thermo公司）；反相高效液相色譜C18色譜柱（Michrom Bioresources公司）；超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物儀器公司）；SCIENTZ11D型高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）。

乙腈、NH4HCO3、三氟乙酸、二硫蘇糖醇、吲哚3乙酸等（Sigma公司）；胰蛋白酶（Promega公司）。南方水牛奶（購(gòu)于廣州市某市場(chǎng)）。

2.2試劑的配制

2.3.2SDSPAGE電泳將分離得到的乳源蛋白SDSPAGE電泳，配制12%分離膠及5%濃縮膠，電泳完畢后用凝膠成像與分析系統(tǒng)對(duì)電泳圖進(jìn)行光密度掃描，以等電點(diǎn)沉淀得到的水牛奶酪蛋白電泳圖作對(duì)比，初步確定分離出的蛋白成分和含量。

2.3.3蛋白膠內(nèi)酶解將獲得的酪蛋白及乳清蛋白SDSPAGE膠分別按以下步驟酶解：切下SDSPAGE凝膠上的目標(biāo)蛋白點(diǎn)分別于編號(hào)EP管中，水洗膠塊兩次，加入適量新鮮脫色劑，37 ℃水浴脫色至膠塊透明，棄液體；再用100% 乙腈脫水至膠塊變?yōu)榘咨?，棄液體；加入5～6 mL 25 mmol/L NH4HCO3（含10 mmol/L DTT）還原劑并封口，57 ℃水浴1 h，取出樣品，冷卻至室溫，棄液體，迅速加入等體積的烷基化試劑，室溫避光放置30 min；去烷基化試劑，加入50%乙腈，靜置15 min；棄液體，加入5～6 mL 50 mmol/L NH4HCO3振蕩?kù)o置吸脹5 min，棄液體；分別用50%和 100%乙腈脫水至膠塊變?yōu)榘咨瑮壱后w。分別加4 μL酶液于各EP管，冰上放置30 min后，吸走多余的酶液，加20 μL覆蓋液并封口，37 ℃保溫18 h。取樣品于10000 g/min條件下超聲5 min，上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，膠塊中加入萃取液，37 ℃保溫30 min， 超聲后與之前上清液混合并真空冷凍干燥，備用。

2.3.4質(zhì)譜分析取凍干的樣品，分別加入4 μL樣品溶解液，充分振蕩渦旋，于4 ℃下，13200 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)行質(zhì)譜分析。樣品先經(jīng)系統(tǒng)的反相高效液色譜C18柱（100 mm×100 μm， 3 μm）分離后，進(jìn)入LTQ Orbitrap系統(tǒng)分析。樣品在反相柱上的洗脫梯度是5%～45%乙腈（含0.1% 甲酸）洗脫60 min，洗脫速度為30 nL/min。質(zhì)譜參數(shù)：離子傳輸管溫度200 ℃；電噴霧電壓是1.85 kV。一級(jí)質(zhì)譜Orbitrap掃描范圍是400～2000 Da，一級(jí)質(zhì)譜里選取信號(hào)最強(qiáng)的10個(gè)母離子做二級(jí)質(zhì)譜分析，動(dòng)態(tài)排除功能開(kāi)啟，時(shí)間90 s。二級(jí)質(zhì)譜LTQ為CID碰撞模式，標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量35%，活化q值0.25，活化時(shí)間30 ms。肽段信息用Mascot軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，得出結(jié)果。

3結(jié)果與討論

3.1水牛奶乳清蛋白的總離子流色譜及二級(jí)質(zhì)譜圖

蛋白酶酶解的水牛乳乳清蛋白、酪蛋白的多肽混合物經(jīng)LTQOrbitrap XL液質(zhì)聯(lián)用分析，獲得樣品的總離子流色譜圖（圖1）。水牛乳乳蛋白多肽混合物總離子流色譜圖縱坐標(biāo)代表物質(zhì)縱聲的總離子信號(hào)，總離子流色譜圖由許多峰組成，這些峰是按色譜峰出峰先后順序排列的，同一峰又由許多不同質(zhì)荷比的碎片組成。同一個(gè)離子流峰中的不同的質(zhì)荷比的碎片由小到大的順序形成質(zhì)譜圖。

4結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)乳源蛋白各個(gè)主要組分進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得水牛奶酪蛋白主要組分（αs1CN，βCN和κCN）和不同來(lái)源乳源乳蛋白主要組分（α乳白蛋白和β乳球蛋白）肽段的氨基酸序列信息，及各組分的完整氨基酸序列。結(jié)果表明，不同品種的乳源乳蛋白的氨基酸序列均不同，存在氨基酸變異現(xiàn)象。在α乳白蛋白的氨基酸序列對(duì)比中，水牛乳和羊奶的差異比荷斯坦奶的差異大；而在β乳球蛋白中， 水牛乳和荷斯坦奶的差異比羊奶的差異大。與酪蛋白相比，不同乳源兩種乳清蛋白的變異現(xiàn)象比酪蛋白少很多[7]； 與乳清蛋白相比，發(fā)生氨基酸差異現(xiàn)象的部位和比率更多； 在酪蛋白的氨基酸序列對(duì)比中， 水牛奶酪蛋白與山羊奶酪蛋白比與乳牛酪蛋白的差異更大。

References

1CHEN JingTing， MA Lu， YANG JinHui， ZHANG JuanXia， LI FaDi， BU DengPan. Chinese Journal of Animal Nutrition， 2013， 25（8）： 1683-1688

2FENG XuDong ，AN WeiDong， DING Yi ，YU AiMin， LIU Jing ，GAO DeJiang， WANG ZhiHong ，YU Yong. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（10）： 1496-1500

3Albreht A， Vovk I. J. Chromatogr. A， 2012， 1227：210-218

4Erve J C L， Gu M， Wang Y D， DeMaio W， Talaat R E. J. Am. Soc .Mass Spectrom.， 2009， 20： 2058-2069

5ZHANG Rui，YUAN MinWei，SHI BingZhao. Chinese J. Pharmaceuticals， 1999， 30（2）： 51-53

6LI YunKai， LI ZiChao， WANG LiNa， XU MingFang. Chinese J. Analysis Laboratory， 2011， 4（30）： 70-72

7CHENG XiFei， LI YunKai， XIANG MingXia， LI ZiChao， XU MingFang. Food Science and Technology， 2012， 11： 289-292

4結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)乳源蛋白各個(gè)主要組分進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得水牛奶酪蛋白主要組分（αs1CN，βCN和κCN）和不同來(lái)源乳源乳蛋白主要組分（α乳白蛋白和β乳球蛋白）肽段的氨基酸序列信息，及各組分的完整氨基酸序列。結(jié)果表明，不同品種的乳源乳蛋白的氨基酸序列均不同，存在氨基酸變異現(xiàn)象。在α乳白蛋白的氨基酸序列對(duì)比中，水牛乳和羊奶的差異比荷斯坦奶的差異大；而在β乳球蛋白中， 水牛乳和荷斯坦奶的差異比羊奶的差異大。與酪蛋白相比，不同乳源兩種乳清蛋白的變異現(xiàn)象比酪蛋白少很多[7]； 與乳清蛋白相比，發(fā)生氨基酸差異現(xiàn)象的部位和比率更多； 在酪蛋白的氨基酸序列對(duì)比中， 水牛奶酪蛋白與山羊奶酪蛋白比與乳牛酪蛋白的差異更大。

References

1CHEN JingTing， MA Lu， YANG JinHui， ZHANG JuanXia， LI FaDi， BU DengPan. Chinese Journal of Animal Nutrition， 2013， 25（8）： 1683-1688

2FENG XuDong ，AN WeiDong， DING Yi ，YU AiMin， LIU Jing ，GAO DeJiang， WANG ZhiHong ，YU Yong. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（10）： 1496-1500

3Albreht A， Vovk I. J. Chromatogr. A， 2012， 1227：210-218

4Erve J C L， Gu M， Wang Y D， DeMaio W， Talaat R E. J. Am. Soc .Mass Spectrom.， 2009， 20： 2058-2069

5ZHANG Rui，YUAN MinWei，SHI BingZhao. Chinese J. Pharmaceuticals， 1999， 30（2）： 51-53

6LI YunKai， LI ZiChao， WANG LiNa， XU MingFang. Chinese J. Analysis Laboratory， 2011， 4（30）： 70-72

7CHENG XiFei， LI YunKai， XIANG MingXia， LI ZiChao， XU MingFang. Food Science and Technology， 2012， 11： 289-292

4結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)乳源蛋白各個(gè)主要組分進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得水牛奶酪蛋白主要組分（αs1CN，βCN和κCN）和不同來(lái)源乳源乳蛋白主要組分（α乳白蛋白和β乳球蛋白）肽段的氨基酸序列信息，及各組分的完整氨基酸序列。結(jié)果表明，不同品種的乳源乳蛋白的氨基酸序列均不同，存在氨基酸變異現(xiàn)象。在α乳白蛋白的氨基酸序列對(duì)比中，水牛乳和羊奶的差異比荷斯坦奶的差異大；而在β乳球蛋白中， 水牛乳和荷斯坦奶的差異比羊奶的差異大。與酪蛋白相比，不同乳源兩種乳清蛋白的變異現(xiàn)象比酪蛋白少很多[7]； 與乳清蛋白相比，發(fā)生氨基酸差異現(xiàn)象的部位和比率更多； 在酪蛋白的氨基酸序列對(duì)比中， 水牛奶酪蛋白與山羊奶酪蛋白比與乳牛酪蛋白的差異更大。

References

1CHEN JingTing， MA Lu， YANG JinHui， ZHANG JuanXia， LI FaDi， BU DengPan. Chinese Journal of Animal Nutrition， 2013， 25（8）： 1683-1688

2FENG XuDong ，AN WeiDong， DING Yi ，YU AiMin， LIU Jing ，GAO DeJiang， WANG ZhiHong ，YU Yong. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（10）： 1496-1500

3Albreht A， Vovk I. J. Chromatogr. A， 2012， 1227：210-218

4Erve J C L， Gu M， Wang Y D， DeMaio W， Talaat R E. J. Am. Soc .Mass Spectrom.， 2009， 20： 2058-2069

5ZHANG Rui，YUAN MinWei，SHI BingZhao. Chinese J. Pharmaceuticals， 1999， 30（2）： 51-53

6LI YunKai， LI ZiChao， WANG LiNa， XU MingFang. Chinese J. Analysis Laboratory， 2011， 4（30）： 70-72

7CHENG XiFei， LI YunKai， XIANG MingXia， LI ZiChao， XU MingFang. Food Science and Technology， 2012， 11： 289-292