劉彤彤　房芳　羅嬌依　曹進　孫姍姍

摘要：目的：建立奶粉中A2 β酪蛋白分離定量的液相色譜高分辨串聯(lián)質(zhì)譜法，并利用嬰兒配方奶粉中酪蛋白、乳清蛋白和總蛋白含量的關系，間接得到乳清蛋白含量。方法：樣品經(jīng)前處理后，采用ACQUITY UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm×1.8 μm），0.1%甲酸水和乙腈為流動相，梯度洗脫分離。多反應離子監(jiān)測模式定量測定其中的A2 β酪蛋白特征肽。結(jié)果：在0.02～2.0 μmol/L范圍內(nèi)線性關系良好（r=0.993 8）。在低、中、高三水平加標試驗中，回收率在94.9%～98.7%，相對標準偏差在1.7%～3.7%，檢出限為0.80 mg/100 g，可滿足對奶粉中A2 β酪蛋白定量要求。采用該法對市售11批聲稱A2奶粉和18批未聲稱A2奶粉（以下簡稱A2奶粉和普通奶粉）中A2 β酪蛋白進行測定。結(jié)論：A2奶粉中A2 β酪蛋白占總β酪蛋白含量的86.2%～98.7%，而普通奶粉則低至20.0%～50.0%。另外，乳清蛋白含量的間接測定值和理論計算值經(jīng)統(tǒng)計分析，無明顯差異（P>0.05），為分析嬰兒配方奶粉中乳清蛋白含量是否符合國標要求提供參考。

關鍵詞：A2 β酪蛋白;液相色譜高分辨串聯(lián)質(zhì)譜;乳清蛋白;奶粉有研究認為，只含有A2 β酪蛋白的牛奶可以預防或緩解因食用普通牛奶而產(chǎn)生的胃腸道不適癥狀[19]。嬰兒配方奶粉為模擬成熟母乳中蛋白配比（乳清蛋白：酪蛋白=6∶4），通過添加濃縮乳清蛋白粉、脫鹽乳清粉強化乳清蛋白的含量。國標（GB10765—2010）[10]中對嬰兒配方奶粉中的乳清蛋白含量做出了明確規(guī)定（≥60%），但乳清蛋白的檢測方法目前沒有國標，現(xiàn)有的檢測方法存在一定缺點和局限性[1112]。乳粉生產(chǎn)企業(yè)往往是根據(jù)乳粉中各原料所含乳清蛋白含量，獲得乳粉中乳清蛋白含量的計算值，難以獲得乳清蛋白含量的測定值。本試驗利用液相色譜高分辨串聯(lián)質(zhì)譜，對市場上A2奶粉和普通奶粉進行檢測分析，建立起奶粉中A2 β酪蛋白分離及定量的方法，為A2奶粉的鑒別提供有效的技術(shù)手段。另外，本研究嘗試利用嬰兒配方奶粉中酪蛋白、乳清蛋白和總蛋白含量的關系，在測定其中酪蛋白含量的基礎上，間接得到乳清蛋白含量，即乳清蛋白=總蛋白含量總酪蛋白含量，以此實現(xiàn)對乳清蛋白的定量。

1材料與方法

1.1試劑與材料

β酪蛋白特征肽段VLPVPQK標準品（純度≥98.57%，分子量=780.0 g/mol）、β酪蛋白特征肽段內(nèi)標SQSKVL*（13C6，15N）PVPQKAVPY（純度≥98.84%，分子量=1 648.0 g/mol）、A2 β酪蛋白特征肽標準品IHPFAQTQSLVYPFPGPIPNSLPQNIPPLTQTPVVVPPFLQPEVMG

VSK（純度≥98%，分子量=5 315.8 g/mol）、A1 β酪蛋白特征肽標準品IHPFAQTQSLVYPFPGPIHNSLPQNIPPLTQTPVVVPPFLQPEVMGVSK（純度≥98%，分子量=5 355.8 g/mol），上海吉爾生化有限公司提供;胰蛋白酶（質(zhì)譜級），美國賽默飛世爾科技公司;甲酸、乙腈（質(zhì)譜級），美國賽默飛世爾科技公司;三羥甲基氨基甲烷（分析純，美國 Sigma Aldrich公司）;Triton X100（分析純），美國 Sigma Aldrich公司;硫酸（分析純），國藥集團化學試劑有限公司;Foss催化劑片，丹麥福斯集團公司;試驗用水為MilliQ超純水。

奶粉樣品共30批，包括普通奶粉18批（均為嬰配）、A2奶粉11批（A2嬰配奶粉5批、A2調(diào)制乳粉6批）、豆基奶粉1批，采購于京東網(wǎng)絡平臺。

1.2儀器與設備

Waters UPLCVevo TQS液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀、Masslynx質(zhì)譜軟件，美國沃特世科技有限公司;B491恒溫水浴鍋，瑞士BUCHI公司;XP 205分析天平，瑞士梅特勒托利多公司;SI VortexGenie 2渦旋振蕩器，美國Scientific Industries公司;賀力氏Pico21離心機，美國賽默飛世爾科技有限公司;凱氏定氮儀Kjeltec 8200，丹麥福斯集團公司。

1.3方法

1.3.1試樣前處理參照孫姍姍等[13]的方法并做適當調(diào)整，稱取試樣1 g（精確至0.001 g）于50 mL容量瓶中，加入30 mL TrisHCl（50 mmol/L）溶液，充分溶解后定容。60 ℃水浴1 h，冷卻混勻后取上述樣液20 mL，加入10 mL NaCl溶液（0.5 mol/L，含0.2%Triton X100）混勻，用3%甲酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.6～4.8，室溫過夜，離心（10 000 r/min、15 ℃、15 min）后棄去上清。用10 mL TrisHCl（50 mmol/L）溶液復溶沉淀，準確移取100 μL上述樣液，加入40 μL β酪蛋白特征肽段內(nèi)標（2.5 μmol/L），10 μL胰蛋白酶液（1 mg/mL），加水定容至1 mL，渦旋混勻后置于37 ℃水浴中恒溫15～16 h，取出加入10 μL 10%的甲酸溶液終止反應，混勻后離心（10 000 r/min、4 ℃、10 min），取上清供檢測用。

1.3.2總蛋白質(zhì)含量測定參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》[14]第一法 凱氏定氮法操作。稱取樣品0.2 g，精確至0.001 g，至消化管中，再加入1片F(xiàn)oss催化劑片（0.4 g CuSO4·5H2O和3.5 g K2SO4）及20 mL硫酸于消化爐進行消化。當消化爐溫度達到420 ℃后，繼續(xù)消化1 h，此時消化管中的液體呈綠色透明狀，取出冷卻后于自動凱氏定氮儀上實現(xiàn)自動加液、蒸餾、滴定和記錄滴定數(shù)據(jù)的過程。

1.3.3標準曲線的配制精確稱取適量標準品，用TrisHCl（50 mmol/L）溶液溶解，得到標準儲備液：β酪蛋白特征肽段和A2 β酪蛋白特征肽標準品濃度均為400 μmol/L，β酪蛋白特征肽段內(nèi)標濃度為10 μmol/L;分別取標準儲備液適量，用TrisHCl（50 mmol/L）溶液稀釋，得到標準中間液：β酪蛋白特征肽段和A2 β酪蛋白特征肽標準品濃度均為4 μmol/L，β酪蛋白特征肽段內(nèi)標標準中間液濃度為2.5 μmol/L;取β酪蛋白特征肽段和A2 β酪蛋白特征肽標準中間液適量，加入內(nèi)標標準中間液40 μL、胰蛋白酶液（1 mg/mL）10 μL，用水定容至1 mL混勻，配置成濃度分別為0.02、0.1、0.2、1.0、2.0 μmol/L的標準工作液，后續(xù)酶解操作和1.3.1樣品酶解同時進行，取上清進樣并繪制標準曲線。

1.3.4色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm× 1.8 μm）;柱溫30 ℃;進樣量5 μL;流速0.3 mL/min。流動相A：0.1%甲酸水溶液。流動相B：乙腈。線性梯度洗脫程序：0～0.5 min，95%A;0.5～4.5 min，95%～50%A;4.5～4.6 min，50%～35%A;4.6～6.6 min，35%A;6.6～6.7 min，35%～95%A;6.7～9.0 min，95%A。

1.3.5質(zhì)譜條件電噴霧離子源正離子模式;毛細管電壓3 500 V，脫溶劑氣溫度500 ℃，脫溶劑氣流速800 L/h。多離子反應監(jiān)測模式，A2 β酪蛋白特征肽檢測離子對m/z 1 330.596→1 297.67和m/z 1 330.596→715.263，碰撞能量為19 V和25 V;A1 β酪蛋白特征肽檢測離子對m/z 1 340.59→1 311和m/z 1 340.59→715.2，碰撞能量為27 V和31 V;β酪蛋白特征肽檢測離子對m/z 391→568和m/z 391→213，碰撞能量為11 V和9 V;β酪蛋白（內(nèi)標）特征肽檢測離子對m/z 394.5→568和m/z 391→285，碰撞能量為11 V和12 V。

2結(jié)果與分析

2.1A1、A2 β酪蛋白標準品和典型的A2、普通奶粉樣品的譜圖分析由圖1可知，A1 β酪蛋白標準品在3.63 min出峰、A2 β酪蛋白標準品在3.84 min出峰，對照圖2的A2、普通奶粉在對應位置的出峰，說明在1.3的前處理及色譜質(zhì)譜條件下，A1和A2 β酪蛋白在樣品中分離情況良好，峰形也符合定量要求。同時可看出，2種奶粉中A1和A2 β酪蛋白的分布及含量區(qū)別。選取的2種奶粉樣品中，普通奶粉中兩種β酪蛋白均有檢出，A2奶粉也檢出少量A1 β酪蛋白。

2.2方法學驗證結(jié)果

2.2.1線性范圍、檢出限和定量限在0.02～2.0 μmol/L范圍內(nèi)，r=0.993 8，表明此范圍內(nèi)建立的標準曲線線性關系良好，可用于定量分析。將前處理得到的樣品溶液稀釋進樣，以信噪比3∶1時的濃度為檢出限，10∶1時的濃度為定量限，得到檢出限和定量限分別為0.80、2.7 mg/100 g。

2.2.2回收率和精密度取不含A2 β酪蛋白的豆基奶粉作為空白基質(zhì)，通過3個加標水平來評估回收率，分別為100、500、1 500 mg/100 g，每個加標水平做6次平行，回收率在94.9%～98.7%，各加標水平的精密度為1.7%～3.7%，表明在該方法條件下，回收率和精密度均良好。

2.3A2奶粉和普通奶粉中A2 β酪蛋白的測定

由表2～3和圖3～4可見，A2奶粉樣品中A2 β酪蛋白測定結(jié)果在1.05～1.83 g/100 g，β酪蛋白在1.07～2.17 g/100 g，A2 β酪蛋白含量占比范圍為86.2～98.7%，約是A1 β酪蛋白含量的6～75倍。普通奶粉中A2 β酪蛋白測定結(jié)果在0.31～1.15 g/100 g，β酪蛋白在1.44～2.31 g/100 g，A2 β酪蛋白含量占比多集中在20.0%～50.0%，A1 β酪蛋白含量約是A2 β酪蛋白的1～4倍，另外，有2份樣品的A2 β酪蛋白含量分別為70.0%、75.0%。

A2奶粉和普通奶粉中A2 β酪蛋白含量差異明顯，本試驗的普通奶粉中A2 β酪蛋白含量范圍（20.0%～50.0%）與Buchberger[15]的測定結(jié)果大體一致（29%～54%），但比Cardak[16]（67%）、馮慿[17]（58.1%～68.8%）和Givens[1]（A2 β酪蛋白含量56.1%～62.1%）的研究結(jié)果低，這可能與奶粉的奶源不同有關，不同地區(qū)奶牛的基因型不同，生產(chǎn)的牛奶中A1和A2 β酪蛋白的比例也有不同程度的差異[1819]，2批普通奶粉中A2 β酪蛋白占比超過70%或許也是因為此原因。本試驗的A2奶粉樣品中檢測出少量的A1 β酪蛋白，馮慿[17]和劉澤陽[20]的研究中也有相似的結(jié)果。一方面可能與A2奶源篩選的方法靈敏度有關[20]，另一方面，部分乳粉生產(chǎn)企業(yè)宣稱在前期進行奶牛和奶源篩選，但缺乏對奶粉成品的A2 β酪蛋白檢測，在生產(chǎn)過程中可能會引入少量A1 β酪蛋白，造成在成品奶粉中檢出。另外，目前國內(nèi)外缺乏A2奶粉中A2 β酪蛋白含量占比的限量標準，難以對其進行評判。根據(jù)本試驗的測定結(jié)果建議，A2奶粉中A2 β酪蛋白含量占比在85%以上可能是比較合理的。

2.4在嬰兒配方奶粉的乳清蛋白含量中的應用

表4中根據(jù)β酪蛋白在總酪蛋白中含量占比（取值36%）[12]和試驗測得的β酪蛋白含量，可得到總酪蛋白計算值，結(jié)合奶粉的總蛋白質(zhì)測定值，即乳清蛋白=總蛋白含量總酪蛋白含量，進而得出乳清蛋白含量間接測定值。根據(jù)乳粉生產(chǎn)企業(yè)的原料中乳清蛋白占比數(shù)據(jù)，計算得到乳清蛋白含量理論計算值。將5批A2嬰兒配方奶粉（表4中樣品1～4號）和5批普通嬰兒配方奶粉（表4中樣品的5～10）的乳清蛋白含量間接測定值與理論計算值進行比較，乳清蛋白含量間接測定值范圍在60.3%～65.3%，乳清蛋白含量理論計算值在60.8%～65.8%，通過t檢驗發(fā)現(xiàn)P值>0.05，兩種類型嬰兒配方奶粉乳清蛋白含量間接測定值和理論計算值之間差異均不顯著，且符合國標要求（≥60%）。

3結(jié)論

本試驗利用液相色譜高分辨串聯(lián)質(zhì)譜，建立起奶粉中A2 β酪蛋白分離及定量的方法，方法回收率、精密度良好。利用本方法對市場上A2奶粉和普通奶粉進行檢測分析，結(jié)合β酪蛋白含量，考察了其中A2 β酪蛋白含量的情況，本方法可作為識別區(qū)分A2和普通奶粉的有效手段。并為未來制定A2奶粉的限值規(guī)定提供了充分的數(shù)據(jù)支持。同時，利用嬰兒配方奶粉中乳清蛋白和酪蛋白的關系，在測定其中酪蛋白含量的基礎上，間接得到乳清蛋白含量，為分析嬰兒配方奶粉中乳清蛋白含量是否符合國標要求提供了參考。

參考文獻

[1]Givens I，Aikman P，Gibson T，et al.Proportions of A1，A2，B and C βcasein protein variants in retail milk in the UK[J].Food Chemistry，2013，139（14）：549552.

[2]Nguyen D D，Solah V A，Busetti F，et al.Application of ultrahigh performance liquid chromatography coupled to highresolution mass spectrometry（Orbitrap）for the determination of betacasein phenotypes in cow milk[J].Food Chemistry，2020（307）：125532.

[3]Poi R D，Dominicis E D，Gritti E，et al.Correction to：development of an LCMS method for the identification of βCasein genetic variants in bovine milk[J].Food Analytical Methods，2020，13（12）：21882191.

[4]Fuerer C，Jenni R，Cardinaux L，et al.Protein fingerprinting and quantification of βcasein variants by ultraperformance liquid chromatographyhighresolution mass spectrometry[J].Journal of Dairy Science，2019，103（2）.

[5]NgKwaiHang K F，F(xiàn) Grosclaude.Genetic Polymorphism of Milk Proteins[J].Springer US，2003.

[6]Bell S J，et al.Health implications of milk containing betacasein with the A2 genetic variant[J].Critical Reviews in Food Science & Nutrition，2006，46（1）：93100.

[7]Noni I D，Cattaneo S.Occurrence of βcasomorphins 5 and 7 in commercial dairy products and in their digests following in vitro simulated gastrointestinal digestion[J].Food Chemistry，2010，119（2）：560566.

[8]Hohmann L G，Yin T，Schweizer H，et al.Comparative effects of milk containing A1 versus A2 βCasein on health，growth and βCasomorphin7 level in plasma of neonatal dairy calves[J].Animals，2020，11（55）：114.

[9]Sun Jianqin，et al.Effects of milk containing only A2 beta casein versus milk containing both A1 and A2 beta casein proteins on gastrointestinal physiology，symptoms of discomfort，and cognitive behavior of people with selfreported intolerance to traditional cows milk[J].Nutrition Journal，2016，15（1）：35.

[10]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 107652010 食品安全國家標準 嬰兒配方食品[S].北京：中國標準出版社，2010.

[11]張京順.乳與乳制品中主要乳清蛋白組分的定量分析檢測方法研究[D].杭州：浙江大學，2012.

[12]李倩.不同熱處理的牛乳乳清蛋白成分的分析及營養(yǎng)價值的評定[D].長春：東北農(nóng)業(yè)大學，2012.

[13]孫姍姍，李婷婷，羅嬌依，等.同位素稀釋質(zhì)譜法測定乳及含乳飲料中的酪蛋白含量[J].食品安全質(zhì)量檢測學報，2018（12）：31473157.

[14]國家食品藥品監(jiān)督管理總局，國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.GB 5009.52016 食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定[S].北京：中國標準出版社，2016.

[15]Buchberger J.Genetic polymorphism of milk proteins：differences between breeds[J].Bulletin of the International Dairy Federation，1995（304）：56.

[16]Cardak A D.Effects of genetic variants in milk protein on yield and composition of milk from holsteinfriesian and simmentaler cows[J].South African Journal of Animal Science，2005，35（1）：4147.

[17]馮慿，丁曉靜，高鐵，等.毛細管區(qū)帶電泳測定液態(tài)奶及奶粉中的A2 β酪蛋白及總β酪蛋白[J].色譜，2020，38（6）：722729.

[18]Truswell，A S.The A2 milk case：a critical review[J].European Journal of Clinical Nutrition，2005，59（5）：623631.

[19]Stanisaw Kamiński，et al.Polymorphism of bovine betacasein and its potential effect on human health[J].Journal of Applied Genetics，2007，48（3）：189198.

[20]劉澤陽，李明，吳佩澤，等.液相色譜高分辨串聯(lián)質(zhì)譜法檢測牛奶中A1和A2 β酪蛋白[J].吉林大學學報（理學版），2021，59（3）：696702.

Determination of A2 βcasein in Milk Powder by Liquid Chromatography High Resolution

Tandem Mass Spectrometry and Study on The Relationship Between βcasein and Whey ProteinLIU Tongtong1，F(xiàn)ANG Fang2，LUO Jiaoyi1，CAO Jin1，SUN Shanshan1（1National Institutes for Food and Drug Control， Beijing 100050， China;

2Zhejiang Grain and Oil Product Quality Inspection Center，Hangzhou 310000，China）Abstract：Objective? A new and sensitive method was developed for the determination of A2 βcasein in milk powder by liquid chromatography high resolution tandem mass spectrometry（LCHRMS/MS）.Then based on the relationship among casein，whey protein and total protein in infant formula，whey protein content was obtained indirectly.Method? A2βcasein was separated on an ACQUITY UPLC HSS T3 column（100 mm×2.1 mm×1.8 μm），and 0.1%（V：V）formatewater and acetonitrile were used as the flow phase for gradient elution and separation.The ntent of A2βcasein in milk powder was calculated by multi reaction ion monitoring mode.Result? A good linearity with r=0.993 8 was achieved within the range from 0.02—2.0 μmol/L.Satisfactory recovery（94.9%—98.7%），relative standard deviation（1.7%～3.7%）and the detection limit（0.80 mg/100 g）were obtained at three levels，which could meet the quantitative requirements of A2 βcasein in milk powder.The contents of A2 βcasein in A2 milk powder（11 batches）and common milk powder（18 batches）were measured by this method.Conclusion? The content of A2 βcasein was 86.2%—98.7% and 20.0%—50.0% respectively.Moreover，there was no significant difference（P>0.05）between the indirect determination value and the theoretical calculation value of whey protein content，which provided reference for the test of whey protein content in infant formula whether met the requirements of national standard or not.

Keywords：A2 βcasein;LCHRMS/MS;whey protein;milk powder

并列第一作者：劉彤彤（1993—），女，碩士，助理研究員，研究方向：食品安全檢測;房芳（1984—），女，碩士，工程師，研究方向：食品真實性檢測。

共同通信作者：孫姍姍（1984—），女，博士，副研究員，研究方向：食品安全檢測、食品的真實性檢驗及過敏原的鑒定;曹進（1971—），男，博士，研究員，研究方向：食品安全檢測。