唐洪濤　夏蕊　遲蕾　劉銳　李詠富

摘要：目的：評價γ射線對赭曲霉毒素A降解的影響和輻射分解產(chǎn)物的特性。方法：對甲醇水溶液中的赭曲霉毒素A（OTA）進(jìn)行60Coγ射線輻照處理。結(jié)果：γ射線能有效地降解水溶液中的OTA，并可以檢測出4種主要的輻解產(chǎn)物。在4 kGy的輻照劑量下，OTA（200 ng/mL）的輻照降解效率可達(dá)90%。一種輻解產(chǎn)物毒性低于OTA，其余產(chǎn)物均無毒性記錄。 OTA可影響小鼠的生長狀態(tài)，如體重增加和食物利用率，OTA的輻射降解產(chǎn)物大多不產(chǎn)生影響。本研究中，OTA可破壞小鼠血小板和淋巴細(xì)胞，增加小鼠血清AST、GLU、BUN，降低LDH。小鼠的某些內(nèi)臟可被OTA破壞，如肝、腎、肺等，但OTA輻解產(chǎn)物對所有臟器均無影響。結(jié)論：OTA對小鼠有毒性作用，OTA降解的輻解產(chǎn)物無明顯毒性作用。

關(guān)鍵詞：赭曲霉毒素A;輻照;輻照產(chǎn)物;降解;毒性赭曲霉毒素A（OTA）是由赭曲霉和青霉產(chǎn)生的一種有毒代謝產(chǎn)物，玉米、小麥等農(nóng)產(chǎn)品較易受到污染。OTA的毒性主要有腎臟毒、肝毒等，并與一種致命的地方性腎臟疾?。ò蜖柛傻胤侥I?。┯嘘P(guān)[1]。此外，Reinhard等[25]通過動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，OTA對動物具有致癌和致畸作用，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將OTA列為2B類人腎致癌物[6]。JECFA規(guī)定OTA在人體中的最大耐受劑量為100 ng/kg[7]。有效降解玉米中赭曲霉毒素A，對于保障食品安全及人體健康具有重要研究意義。食品輻照是一種新型的綠色保鮮技術(shù)，長期以來被實踐證明是一種有效的無污染食品保鮮方法[89]。在所有毒素降解方法中，γ射線降解具有許多其他方法無法比擬的優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于毒素的降解[10]。目前，對OTA的輻解產(chǎn)物及其毒性的研究還沒有定論。針對食品成分復(fù)雜的特點，本研究設(shè)計了以水為基質(zhì)的實驗，研究了γ射線對OTA的降解效果，并對輻照產(chǎn)物進(jìn)行了分析。由于玉米基質(zhì)的復(fù)雜性，對輻解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析比較困難，本實驗通過毒理學(xué)實驗對OTA及其輻照產(chǎn)物的毒性進(jìn)行了研究，從而闡明輻解產(chǎn)物的安全性，分析降解產(chǎn)物對小鼠的毒性作用。本研究綜合考慮玉米貯藏過程中OTA的實際污染狀況、輻照降解情況及保證輻照后不引起玉米營養(yǎng)品質(zhì)的變化，在毒理學(xué)實驗中OTA濃度選擇40 μg/kg，輻照劑量選擇10 kGy。

1材料與方法

1.1材料與試劑

赭曲霉毒素A（OTA，純度>98%），購自Fermentek公司;甲醇（色譜純），購自Sigma公司;Balb/c小鼠：重量為（25±2）g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的制備

為進(jìn)行降解效果實驗，將1 mg OTA溶于100 mL甲醇中，經(jīng)梯度稀釋制成500、200、100、50、10、5、1 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)液（稀釋液為6：4體積甲醇水）。對于輻解產(chǎn)物實驗，在10 mL甲醇中溶解1 mg OTA制備標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后稀釋成50 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)液（稀釋液為6：4體積甲醇水）。

1.3γ射線輻照處理

在降解率實驗中，OTA溶液（200 ng/mL）裝于密封的玻璃離心管中，在室溫下輻照，輻照劑量為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 kGy。輻照處理地點在北京大學(xué)輻照中心，劑量率為0.31 Gy/s，實際吸收劑量用重鉻酸銀（Ag2Cr2O7）測定計算得到。降解效率（η，%）根據(jù)式（1）計算[11]。

（1）

式（1）中，η是降解效率 （%）、Q0是樣品的初始濃度 （mg/L）、Qt是輻照后樣品的濃度（mg/L）。

色譜條件：HPLCFLD系統(tǒng)（Agilent1100系列，美國），ORBAXSBAQ柱（2.1 mm×3.5 μm×100 mm，流動相為V（甲醇）：V（水）：V（甲酸）=60∶40∶0.1，流速為0.3 mL/min，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量5.0 μL，熒光檢測器激發(fā)波長333 nm，發(fā)射波長477 nm。標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線揭示了峰面積和OTA濃度的線性關(guān)系，線性方程為y=2 011.8x-2 730.6（R2=0.999 8），其中x是OTA的濃度、y是色譜峰面積。 檢出限為0.6 μg/mL。 所有樣品進(jìn)行三平行實驗。

1.4OTA輻解產(chǎn)物

對于輻解產(chǎn)物實驗，在室溫下用10 kGy的劑量對密封在玻璃離心管中的OTA溶液（50 μg/mL進(jìn)行輻照。采用高效液相色譜法（Agilent1100系列，美國），配備ESIQTOFMS檢測器（Agilent 6510，美國），對放射性產(chǎn)物進(jìn)行分析。

1.4.1LC系統(tǒng)運行條件色譜柱為ZORBAX Eclipse PlusC18（2.1 mm×3.5 μm×100 mm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A相）和乙腈（B相）。在10 min內(nèi)，乙腈（B相）從5%變?yōu)?0%，并保持2.1 min;然后在5.9 min的時間內(nèi)，乙腈（B相）從90%變?yōu)?%，分析終止時間為18 min、進(jìn)樣量為20 μL、流速為0.3 mL/min。

1.4.2質(zhì)量系統(tǒng)的運行條件離子源為ESI、離子噴霧電壓為3 800 V、干燥氣體溫度為350 ℃、干燥氣體流速為10.0 L/min、霧化氣體為N2、極性選擇為正、霧化壓力為40.0 psig、碰撞能量為15 eV[12]。

1.5體內(nèi)毒性研究

所有動物都被保存在無病原體的環(huán)境中，并按實驗要求喂食。照料和使用動物的程序得到了綜合農(nóng)村發(fā)展中心倫理委員會的批準(zhǔn)，并遵循了所有有關(guān)動物倫理使用的條例。將小鼠分為3組，分別為對照組，輻解產(chǎn)物組和OTA組。每組10只小鼠，適應(yīng)期1周。實驗周期持續(xù)90天。在此期間，動物自由飲食和飲水。對照組小鼠采用正常飼料喂養(yǎng);輻照產(chǎn)物組用輻照玉米添加1/4的專用飼料喂養(yǎng)小鼠;OTA組用未經(jīng)輻照處理玉米添加1/4的專用飼料喂養(yǎng)小鼠。在飼養(yǎng)期間，每天觀察記錄小鼠的狀態(tài)和實驗指標(biāo)。

食物攝入量=添加量-殘留量（2）

食物利用效率=一定時間內(nèi)的體重增加量/一定時間內(nèi)的攝食量*100（3）

血液指標(biāo)檢測實驗結(jié)束時，禁食12 h，所有動物均從眼眶采血，置入抗凝管，然后電擊，防止凝血，檢測全血細(xì)胞計數(shù)。盡可能多的采集血液，在無菌離心管中采血，放置30 min后加入低速離心機(jī)，以3 000 r/min離心10 min，取血清，檢測血液生化指標(biāo)（ALT、AST、TP、ALB、GLB、CREA、GLU、BUN、CHOL、TGB、LDH）。使用Windows的統(tǒng)計分析SPSS版本11.5來評估數(shù)據(jù)。 數(shù)據(jù)采用方差分析檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2結(jié)果與分析

2.1γ射線對水溶液中OTA降解的影響

根據(jù)色譜峰面積，計算不同輻照劑量下OTA的降解率η。 在不同的γ輻照劑量下，OTA具有顯著的降解應(yīng)（圖1）。當(dāng)輻照劑量低于1.0 kGy時，降解率要低得多，因為在低照射劑量下沒有足夠的自由基產(chǎn)生。 隨著輻照劑量的增加，降解率也隨之提高。在4 kGy的劑量下，降解率可達(dá)90%，然后趨于穩(wěn)定，這一現(xiàn)象在以往關(guān)于輻照誘導(dǎo)脫氫乙酸鈉在水溶液中降解的研究中也有發(fā)現(xiàn)[1314]。

2.2輻照產(chǎn)物質(zhì)譜分析

通過數(shù)據(jù)庫檢索輻射分解產(chǎn)物的可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)。 當(dāng)匹配分?jǐn)?shù)達(dá)到90%時，該分子一般視為降解產(chǎn)物。此外，它還可以在5 mg/L的質(zhì)量范圍內(nèi)提供質(zhì)量精度。然后根據(jù)碎片信息和OTA裂解過程推導(dǎo)出產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。LC/TOFMS對4種主要輻解產(chǎn)物的準(zhǔn)確信息如表1所示。輻照前后，OTA及輻照后OTA降解產(chǎn)物的總離子色譜圖（TIC）通過LC/TOFMS獲得（圖2）。消除雜質(zhì)和對照，LC/TOFMS共檢測4個降解產(chǎn)物，然后分別提取每個峰的二級質(zhì)譜信息，獲得相關(guān)離子碎片信息，并對輻解產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。 首先，甲醇水溶液在輻照的過程中會產(chǎn)生羥基自由基（OH）和甲基自由基（CH3），OTA分子結(jié)構(gòu)中的酰胺鍵在羥基自由基（OH）的作用下裂解，形成降解產(chǎn)物A（苯基丙氨酸）和降解產(chǎn)物B（8羥基3，4二甲基1戊內(nèi)酯7羧酸），降解產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)如圖2B和圖2C所示;此外，羥基自由基（OH）和甲基自由基（CH3）會同OTA分子發(fā)生加成反應(yīng)，羥基自由基（OH）和甲基自由基（CH3）分別到OTA內(nèi)酯環(huán)，形成新的化合物C（5氯8羥基3，4二甲基1戊內(nèi)酯7羰基苯基丙氨酸）和D（5氯4，8二羥基3甲基7羰基苯基丙氨酸），其分子結(jié)構(gòu)如圖2D和圖2E所示。

2.3玉米中OTA和輻解產(chǎn)物對小鼠體重的影響

攝入OTA后，小鼠會出現(xiàn)中毒癥狀，如嗜睡、乏力等。 增重和飼料效率的變化將有助于我們研究OTA對其他方面的損害。 研究表明，高濃度真菌毒素污染可導(dǎo)致動物采食量顯著降低，影響飼料利用率和體重增加。表2表明，玉米中OTA和輻射分解產(chǎn)物對小鼠體重增加的影響。 在實驗中，對照組和輻照組的小鼠精神和活動無異常，無死亡。 然而，在OTA組，6周后，小鼠移動緩慢，1只在9周后死亡。 前5周無顯著性差異（P>0.05），后續(xù)時間OTA組與對照組和輻照組比較有顯著性差異（P<0.05或P<0.01）。對照組和輻照組，除第6 w外無顯著差異（P>0.05），這是由于OTA在10 kGy劑量下未完全降解所致，因此無統(tǒng)計學(xué)意義。表3表明，玉米中OTA和輻射分解產(chǎn)物對小鼠飼料效率的影響。與對照組相比，OTA組和降解產(chǎn)物組小鼠的飼料效率沒有顯著差異（P>0.05）。 從第3周開始，OTA組開始出現(xiàn)顯著差異（P<0.05或P<0.01）。 對照和降解產(chǎn)物組除第5周外無顯著性差異（P>0.05），這是由于OTA在10 kGy劑量下沒有完全降解，因此沒有統(tǒng)計學(xué)意義。研究表明，OTA對小鼠有一定的損傷，而降解產(chǎn)物對小鼠的毒性較小。本研究結(jié)果與遲蕾實驗[12]的結(jié)果一致。

2.4玉米中OTA和輻解產(chǎn)物對小鼠血液常規(guī)指標(biāo)的影響

表4顯示了玉米中OTA和輻解產(chǎn)物對小鼠血液生化參數(shù)的影響。 尿氮是腎功能的指標(biāo)，在嚴(yán)重的腎臟損害中會顯著增加[15]。 本研究中，OTA組的尿氮水平明顯高于其他2組，表明OTA可損傷腎臟。 谷草轉(zhuǎn)氨酶和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶是肝功能指標(biāo)[16]。 在OTA組中，谷草轉(zhuǎn)氨酶的顯著增加表明OTA破壞了肝臟，結(jié)論與Malekinejad的研究一致[17]。 然而，輻射分解產(chǎn)物對腎臟和肝臟的危害較小。乳酸脫氧酶是一種能催化乳酸生成丙酮酸的酶，幾乎存在于血液中的所有組織中。在OTA組中，乳酸脫氧酶水平顯著降低，導(dǎo)致代謝異常[12，18]。同時，OTA使神經(jīng)系統(tǒng)紊亂導(dǎo)致血糖水平升高。 我們的結(jié)果與Stoycho實驗[19]的結(jié)果一致。

表5顯示了玉米中OTA和輻解產(chǎn)物對小鼠血液常規(guī)指標(biāo)的影響。OTA組的血小板水平顯著低于對照組和輻照降解組，而淋巴細(xì)胞水平顯著高于對照組和輻照降解組。 血小板的主要作用是促進(jìn)止血和加速凝血，維持毛細(xì)血管壁的完整性。研究表明，OTA可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增高，但目前尚未有相關(guān)解釋。我們推測原因主要是OTA引起的炎癥反應(yīng)。同時OTA可改變紅細(xì)胞和白細(xì)胞水平，其結(jié)論存在一定差異，其原因是劑量效應(yīng)。而輻解產(chǎn)物組與對照組無差異。

3討論

在不同的γ輻照劑量下，OTA具有顯著的降解效應(yīng)，在本研究中，在10 kg計量輻照下，OTA的降解效率可超過90%。OTA 經(jīng)輻照降解后，可產(chǎn)生4種不同的輻解產(chǎn)物，經(jīng)質(zhì)譜儀分析確定降解產(chǎn)物為苯基丙氨酸、8羥基3，4二甲基1戊內(nèi)酯7羧酸、5氯8羥基3，4二甲基1戊內(nèi)酯7羰基苯基丙氨酸和5氯4，8二羥基3甲基7羰基苯基丙氨酸。經(jīng)過動物實驗，可進(jìn)一步確認(rèn)OTA對小鼠的體重及其他血液指標(biāo)的損害，而輻照分解產(chǎn)物則無相應(yīng)毒性，對腎臟和肝臟的危害也較小。輻照處理可以有效降解OTA，并降低其生物毒性，是降低污染玉米中赭曲霉毒素A的有效手段。參考文獻(xiàn)

[1]Krogh P.Role of ochratoxin in disease causation[J]. Food Chem Toxicol，1992，30（3）：213224.

[2]Reinhard M，Marion R，Winni van H，Koop F.Determination of ochratoxin A in liquorice products using HPLC based analytical methods.Part I：proficiency test of methods commonly used by the confectionary industry[J]. Mycotox Res，2010（26）：9399.

[3]Sava V，Reunova O，Velasuez A，et al.Acute neurotoxic effects of the fungal metabolite ochratoxin A[J]. Neuro Toxicology，2006，27（1）：8292.

[4]Muller G，Kielstein P，Kohler H，et al.Studies of the influence of ochratoxin A on immune and defense reactions in the mouse model[J]. Mycoses，1995，38（1/2）：8591.

[5]Creppy E.Genotoxicity of ochratoxin A in mice：DNA single strand breaks evaluation in spleen，liver and kidney[J]. Toxicol Lett，1985，28 （1）：2935.

[6]IARC.IARC Monographs on the overall evaluations of carcinogenicity to humans，vols.173.International Agency for Research on Cancer，Lyon，F(xiàn)rance，1999：136.

[7]JECFA.Evaluation of certain mycotoxins in food[C].Fiftysixth report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives，2001：2635.

[8]哈益明.輻照食品及其安全性[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

[9]施培新.食品輻照加工原理與技術(shù)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2004.

[10]遲蕾，哈益明，王峰.γ射線對赭曲霉毒素A 的輻照降解與產(chǎn)物分析[J].食品科學(xué)，2010，31（11）：320324.

[11]B G Zheng，Z Zheng，J B Zhang，et al.Degradation of the emerging contaminant ibuprofen in aqueous solution by gamma irradiation[J].Desalination，2011，276（13）：379385.

[12]遲蕾.玉米中赭曲霉素A輻照降解技術(shù)研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2011.

[13]Li Y F，Shi B，He Y B，et al.Gamma irradiationinduced degradation of dehydroacetic acid and sodium dehydroacetate in aqueous solution and pear juice[J]. LWT Food Science and Technology，2020（134）：110013.

[14]遲蕾，哈益明，王鋒，等.玉米中赭曲霉毒素A 的輻照降解效果[J]. 食品科學(xué)，2011（11）：2932.

[15]Yenilmez A，Isikli B，Aral E，et al.Antioxidant effects of melatonin and coenzyme Q10 on oxidative damage caused by singledose ochratoxin A in rat kidney[J]. Chinese Journal of Physiology，2010，53（5）：310317.

[16]張祥斌，曹永長，冀君，等.赭曲毒素A對黃羽肉雞生產(chǎn)性能的影響[J]. 中國家禽，2008（15）：1619.

[17]Malekinejad H，F(xiàn)arshid A A，Mirzakhani N.Liquorice plant extract reduces ochratoxin Ainduced nephrotoxicity in mice[J].Experimental and Toxicologic Pathology，2011（63）：125130.

[18]StuderRohr J，Schlatter J，Dietrich DR.Intraindividual variation in plasma levels and kinetic parameters of ochratoxin A in humans.Arch[J].Toxicology，2000（74）：499505.

[19]Stoev S D，Djuvinov D，Mirtcheva T，et al.Studies on some feed additives giving partial protection against ochratoxin A toxicity in chicks[J]. Toxicology Letters，2002，135（12）：3350.

Irradiation Degradation of Ochratoxin A and Toxicity Assessment of Radiolysis Products in MaizeTANG Hongtao1，XIA Rui 1，CHI Lei 2，LIU Rui 3，LI Yongfu 4

（1National Center for Child Nutriment Quality Supervision and Testing，Beijing 100035，China;2 Beijing Chemical Industry Press，

Beijing 100011，China;3Institute of Food and Nutrition Development，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Beijing 100081，China;

4Integrated Rural Development Center，Guizhou Provincial Academy of Agricultural Science，Guiyang 550006，China）Abstract：Objective To evaluate the effects of γrays on degradation and the characteristics of radiolysis products.Method Ochratoxin A （OTA）in aqueous solution was irradiated by 60Coγ ray.Result OTA in aqueous solution can be degradated by γrays effectively and four main radiolysis products were determined.At the dose of 4 kGy，the irradiation degradation efficiency of OTA （200 ng/mL）was up to 90%.The toxicity of one of radiolysis products was lower than OTA，and the others were no toxic records.OTA can affect the growth status of mice，such as weight gain and food utilization，and most the radiolysis products of OTA brought out no effects.In this animal experiment，OTA can destroy platelets and lymphocytes，increase ast，Glu，bun and decrease LDH.Some viscera of mice could be destroyed by OTA，such as liver，kidney，lung，etc，but the radiolysis products of OTA had no effect on all viscera.Conclusion OTA has toxic effect on mice，but the radiolysis products degraded by OTA have no obvious toxic effect.

Keywords：Ochratoxin A;irradiation;radiolysis products;degradation;toxicity

基金項目：貴州省特色農(nóng)產(chǎn)品輻照保鮮與加工工程技術(shù)研究中心（項目編號：黔科合人才平臺字[2016]5203號）;貴州省特色農(nóng)產(chǎn)品輻照保鮮技術(shù)服務(wù)企業(yè)行動計劃（項目編號：黔科合人才平臺字[2016]5712號）。

作者簡介：唐洪濤（1986—），男，工程師，研究方向：食品營養(yǎng)與加工、食品檢測、食育教育等。

通信作者：李詠富（1985—），男，博士，副研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工。