李陽(yáng)等

摘要：以溶劑提取固相萃取為前處理方式，建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)飼料中3種氯丙那林異構(gòu)體和巴氯芬的新方法。試樣用0.1 mol/L HCl甲醇（4∶1， V/V）溶劑振蕩提取20 min，離心去雜質(zhì)后由MCX柱凈化、濃縮，經(jīng)Waters BEH C18色譜柱梯度洗脫分離，串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，正離子掃描，并以外標(biāo)法計(jì)算結(jié)果。方法檢出限為20 μg/kg，定量限為50 μg/kg。4種目標(biāo)化合物在3個(gè)添加水平上進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，回收率均在80%～110%之間；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于或等于10.2%。

關(guān)鍵詞：飼料； 氯丙那林； 異構(gòu)體； 巴氯芬； 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

1引言

氯丙那林（Clorprenaline）屬于β2受體激動(dòng)劑類(lèi)藥物，醫(yī)學(xué)上主要用于擴(kuò)張支氣管和增加肺通氣量，可治療哮喘和肺炎。將其添加到飼料或動(dòng)物飲用水中飼喂動(dòng)物能夠起到提高酮體瘦肉率，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的作用[1]，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新型“瘦肉精”替代品[2]。巴氯芬（Baclofen）屬于鎮(zhèn)靜劑類(lèi)藥物，主要用于骨骼肌松馳，緩解痙攣及外傷等[3]，在畜牧養(yǎng)殖過(guò)程中使用能夠抗驚厥、減少動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)消耗、增加體重，該藥物也是近些年在動(dòng)物產(chǎn)品安全監(jiān)管中新發(fā)現(xiàn)的違禁添加物。食用含有氯丙那林和巴氯芬的動(dòng)物產(chǎn)品易出現(xiàn)毒副作用，對(duì)人體健康造成一定程度損害。2002年，我國(guó)農(nóng)業(yè)部已發(fā)布176號(hào)公告明令禁止在畜牧養(yǎng)殖過(guò)程中使用β2受體激動(dòng)劑和鎮(zhèn)靜劑類(lèi)藥物。但是，仍有一些新型藥物被違法添加使用的現(xiàn)象出現(xiàn)。因此，建立相應(yīng)檢測(cè)方法是很有必要的。

目前，關(guān)于氯丙那林和巴氯芬的檢測(cè)方法已有報(bào)道，實(shí)驗(yàn)樣品主要有飼料[4]、血清[5]、尿液[6]、組織[7]、原料藥[8]、牛奶[9]等。色譜法是主要的分離方法，包括反相液相色譜法[1，2，5，8，9]、離子色譜法[10]、氣相色譜法[11]以及毛細(xì)管電泳法[12]等。常用的檢測(cè)器包括熒光檢測(cè)器[12，13]、紫外檢測(cè)器[1，8，13]、電導(dǎo)檢測(cè)器[10]及質(zhì)譜[5～7，9，11，14]等。在飼料中違禁藥物監(jiān)測(cè)過(guò)程中，經(jīng)常應(yīng)用單四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)行非針對(duì)性篩查，以發(fā)現(xiàn)違禁添加物。由于氯丙那林和巴氯芬的理論分子量分別為213.7069和213.6635（由Waters Masslynx 4.1 Molecular calculator計(jì)算得到），二者數(shù)值接近，如果應(yīng)用一級(jí)質(zhì)譜篩查，則難以對(duì)二者進(jìn)行準(zhǔn)確定性。此外，氯丙那林含有苯環(huán)一氯取代結(jié)構(gòu)，存在鄰、間、對(duì)位置異構(gòu)體，在色譜分離上有不同保留時(shí)間的差異，如果只應(yīng)用其中一種異構(gòu)體的保留時(shí)間進(jìn)行確證，容易將異構(gòu)體判定為非目標(biāo)化合物，給違禁藥物監(jiān)管帶來(lái)漏洞。圖1為巴氯芬和3種氯丙那林異構(gòu)體結(jié)構(gòu)式。本研究采用溶劑提取后，經(jīng)固相萃取凈化、濃縮，反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，通過(guò)優(yōu)化前處理方法以及儀器檢測(cè)參數(shù)，建立了針對(duì)巴氯芬和3種氯丙那林異構(gòu)體的檢測(cè)方法。本方法適用于飼料實(shí)際樣品分析，結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏。

3結(jié)果與討論

3.1質(zhì)譜和色譜條件優(yōu)化

氯丙那林為β2受體激動(dòng)劑類(lèi)藥物，屬于堿性化合物，pKa>7[15]；巴氯芬為酸堿兩性化合物，在水中pKa值為3.87和9.62[16]。4種目標(biāo)化合物均可采用正離子電離模式和反相液相色譜分離。通常向流動(dòng)相中添加適量甲酸將有助于堿性物質(zhì)電離，并使目標(biāo)化合物色譜柱保留時(shí)間提前。在此基礎(chǔ)上，本研究分別采用乙腈0.1%甲酸、乙腈水、甲醇0.1%甲酸、甲醇水作為流動(dòng)相，考察Acquity Uplc BEH C18和Acquity Uplc shield RP 18色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物色譜分離及質(zhì)譜電離的影響。結(jié)果表明，流動(dòng)相中添加甲酸后待測(cè)物質(zhì)的信號(hào)強(qiáng)度明顯提高，甲醇和乙腈作為流動(dòng)相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度影響并不顯著。但使用乙腈時(shí)，間位氯丙那林和對(duì)位氯丙那林異構(gòu)體分離度較差（圖2A）。Acquity Uplc BEH C18和Acquity Uplc shield RP 18色譜柱對(duì)4種化合物均能實(shí)現(xiàn)基線分離，與后者相比，4種化合物在Acquity Uplc BEH C18上保留時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，巴氯芬與3種氯丙那林異構(gòu)體更好地實(shí)現(xiàn)分離，去雜能力更強(qiáng)。圖2C為使用Acquity Uplc BEH C18的分離效果圖，圖2B為使用Acquity Uplc shield RP 18色譜柱分離效果圖。綜合考慮檢測(cè)時(shí)間、分離效果以及試劑毒性等因素，本研究采用甲醇0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相，Acquity Uplc BEH C18色譜柱作為色譜條件。圖2定量離子提取離子色譜圖中4種化合物濃度均為1.0 μg/L。

質(zhì)譜條件優(yōu)化過(guò)程中，首先采用濃度為1.0 mg/L上述4種待測(cè)目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液分別上機(jī)測(cè)定。在正離子模式下，進(jìn)行母離子全掃描。確定分子離子，并對(duì)儀器電離電壓、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定兩個(gè)子離子作為定性離子，并選擇其中之一作為定量離子。

3.2樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

氯丙那林和巴氯芬均具有弱堿性，在酸性條件下帶正電，易被水、水溶性溶劑或它們的混合溶劑提取。提取液pH值和有機(jī)溶劑比例是影響提取效率的兩大因素。本研究對(duì)比了添加濃度為50 μg/kg水平下，3種濃度HCl溶液混合不同比例甲醇的提取效果。圖3為不同提取條件下的平均回收率，當(dāng)提取條件為0.1 mol/L HCl甲醇（4∶1， V/V）時(shí)，目標(biāo)化合物的回收率綜合水平較高，均在85%～110%之間。由4種目標(biāo)化合物回收率隨HCl濃度及有機(jī)相比例變化趨勢(shì)圖可見(jiàn)，4種目標(biāo)化合物在有機(jī)相比例為20%～50%范圍內(nèi)，回收率均較高，證明添加適量有機(jī)溶劑有助于目標(biāo)物提取。當(dāng)有機(jī)相比例小于50%時(shí)，HCl濃度對(duì)3種氯丙那林異構(gòu)體回收率影響較大，回收率隨HCl濃度增大而提高；但在此范圍內(nèi)，HCl濃度對(duì)巴氯芬回收率影響較小。當(dāng)有機(jī)相比例大于50%時(shí)，隨著有機(jī)相比例增加，目標(biāo)化合物回收率呈下降趨勢(shì)。當(dāng)提取液為100%甲醇時(shí)，4種目標(biāo)化合物回收率均較低。

本研究比較了C18柱、HLB柱、MCX柱、WCX柱的不同凈化效果。結(jié)果表明，WCX柱對(duì)目標(biāo)化合物保留效果較差，C18柱、HLB凈化后雜質(zhì)較多，基質(zhì)效應(yīng)較大。由于MCX柱是利用陽(yáng)離子交換作用保留目標(biāo)化合物，待測(cè)的4種化合物均為堿性化合物，pKa>7，在酸性條件下帶正電，MCX對(duì)其柱具有較好的吸附作用。甲酸和甲醇不能將目標(biāo)化合物洗脫，但能達(dá)到洗脫極性和非極性雜質(zhì)的作用，所以選擇甲酸和甲醇作為淋洗溶液。氨化甲醇是MCX柱常用的洗脫溶劑，為保證目標(biāo)化合物完全被洗脫，本研究采用了5% 氨化甲醇溶液，洗脫體積為5.0 mL。綜合以上條件， 選擇0.1 mol/L HCl甲醇（4∶1， V/V）為樣品提取溶液，經(jīng)MCX柱保留后，使用0.2%甲酸和甲醇淋洗雜質(zhì)，再用5%氨化甲醇洗脫，洗脫液雜質(zhì)少，并且容易吹干，有很好的凈化和濃縮效果。

3.3基質(zhì)效應(yīng)考察

采用提取后添加法定量測(cè)定空白基質(zhì)提取液與純?nèi)軇┲型瑵舛确治鑫锏碾x子響應(yīng)強(qiáng)度，通過(guò)公式ME（%）=基質(zhì)溶液中分析物峰面積/純?nèi)軇┲蟹治鑫锓迕娣e，分別在3個(gè)不同濃度下評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。ME<1，基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的響應(yīng)產(chǎn)生抑制作用；ME>1，基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的響應(yīng)產(chǎn)生增強(qiáng)作用；ME=1，不存在基質(zhì)效應(yīng)。如圖4所示，樣品基質(zhì)對(duì)4種分析物均有一定程度抑制作用，但在3個(gè)濃度水平下，ME均在80%～100%范圍內(nèi)，表明本研究所建立前處理方法去雜質(zhì)效果較好。因此，可以采用純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量計(jì)算。

3.6實(shí)際樣品檢測(cè)

利用本方法對(duì)收集的21份飼料實(shí)際樣品進(jìn)行了檢測(cè)（包括豬配合飼料5份，小、中、大豬用濃縮飼料6份，肉牛濃縮飼料2份，肉牛精料補(bǔ)充料2份，肉羊?qū)Ｓ脻饪s飼料2份，肉羊?qū)Ｓ镁涎a(bǔ)充料2份，兔全價(jià)配合飼料2份），所有樣品中均未檢出4種目標(biāo)化合物。

References

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本研究比較了C18柱、HLB柱、MCX柱、WCX柱的不同凈化效果。結(jié)果表明，WCX柱對(duì)目標(biāo)化合物保留效果較差，C18柱、HLB凈化后雜質(zhì)較多，基質(zhì)效應(yīng)較大。由于MCX柱是利用陽(yáng)離子交換作用保留目標(biāo)化合物，待測(cè)的4種化合物均為堿性化合物，pKa>7，在酸性條件下帶正電，MCX對(duì)其柱具有較好的吸附作用。甲酸和甲醇不能將目標(biāo)化合物洗脫，但能達(dá)到洗脫極性和非極性雜質(zhì)的作用，所以選擇甲酸和甲醇作為淋洗溶液。氨化甲醇是MCX柱常用的洗脫溶劑，為保證目標(biāo)化合物完全被洗脫，本研究采用了5% 氨化甲醇溶液，洗脫體積為5.0 mL。綜合以上條件， 選擇0.1 mol/L HCl甲醇（4∶1， V/V）為樣品提取溶液，經(jīng)MCX柱保留后，使用0.2%甲酸和甲醇淋洗雜質(zhì)，再用5%氨化甲醇洗脫，洗脫液雜質(zhì)少，并且容易吹干，有很好的凈化和濃縮效果。

3.3基質(zhì)效應(yīng)考察

采用提取后添加法定量測(cè)定空白基質(zhì)提取液與純?nèi)軇┲型瑵舛确治鑫锏碾x子響應(yīng)強(qiáng)度，通過(guò)公式ME（%）=基質(zhì)溶液中分析物峰面積/純?nèi)軇┲蟹治鑫锓迕娣e，分別在3個(gè)不同濃度下評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。ME<1，基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的響應(yīng)產(chǎn)生抑制作用；ME>1，基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的響應(yīng)產(chǎn)生增強(qiáng)作用；ME=1，不存在基質(zhì)效應(yīng)。如圖4所示，樣品基質(zhì)對(duì)4種分析物均有一定程度抑制作用，但在3個(gè)濃度水平下，ME均在80%～100%范圍內(nèi)，表明本研究所建立前處理方法去雜質(zhì)效果較好。因此，可以采用純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量計(jì)算。

3.6實(shí)際樣品檢測(cè)

利用本方法對(duì)收集的21份飼料實(shí)際樣品進(jìn)行了檢測(cè)（包括豬配合飼料5份，小、中、大豬用濃縮飼料6份，肉牛濃縮飼料2份，肉牛精料補(bǔ)充料2份，肉羊?qū)Ｓ脻饪s飼料2份，肉羊?qū)Ｓ镁涎a(bǔ)充料2份，兔全價(jià)配合飼料2份），所有樣品中均未檢出4種目標(biāo)化合物。

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本研究比較了C18柱、HLB柱、MCX柱、WCX柱的不同凈化效果。結(jié)果表明，WCX柱對(duì)目標(biāo)化合物保留效果較差，C18柱、HLB凈化后雜質(zhì)較多，基質(zhì)效應(yīng)較大。由于MCX柱是利用陽(yáng)離子交換作用保留目標(biāo)化合物，待測(cè)的4種化合物均為堿性化合物，pKa>7，在酸性條件下帶正電，MCX對(duì)其柱具有較好的吸附作用。甲酸和甲醇不能將目標(biāo)化合物洗脫，但能達(dá)到洗脫極性和非極性雜質(zhì)的作用，所以選擇甲酸和甲醇作為淋洗溶液。氨化甲醇是MCX柱常用的洗脫溶劑，為保證目標(biāo)化合物完全被洗脫，本研究采用了5% 氨化甲醇溶液，洗脫體積為5.0 mL。綜合以上條件， 選擇0.1 mol/L HCl甲醇（4∶1， V/V）為樣品提取溶液，經(jīng)MCX柱保留后，使用0.2%甲酸和甲醇淋洗雜質(zhì)，再用5%氨化甲醇洗脫，洗脫液雜質(zhì)少，并且容易吹干，有很好的凈化和濃縮效果。

3.3基質(zhì)效應(yīng)考察

采用提取后添加法定量測(cè)定空白基質(zhì)提取液與純?nèi)軇┲型瑵舛确治鑫锏碾x子響應(yīng)強(qiáng)度，通過(guò)公式ME（%）=基質(zhì)溶液中分析物峰面積/純?nèi)軇┲蟹治鑫锓迕娣e，分別在3個(gè)不同濃度下評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。ME<1，基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的響應(yīng)產(chǎn)生抑制作用；ME>1，基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的響應(yīng)產(chǎn)生增強(qiáng)作用；ME=1，不存在基質(zhì)效應(yīng)。如圖4所示，樣品基質(zhì)對(duì)4種分析物均有一定程度抑制作用，但在3個(gè)濃度水平下，ME均在80%～100%范圍內(nèi)，表明本研究所建立前處理方法去雜質(zhì)效果較好。因此，可以采用純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量計(jì)算。

3.6實(shí)際樣品檢測(cè)

利用本方法對(duì)收集的21份飼料實(shí)際樣品進(jìn)行了檢測(cè)（包括豬配合飼料5份，小、中、大豬用濃縮飼料6份，肉牛濃縮飼料2份，肉牛精料補(bǔ)充料2份，肉羊?qū)Ｓ脻饪s飼料2份，肉羊?qū)Ｓ镁涎a(bǔ)充料2份，兔全價(jià)配合飼料2份），所有樣品中均未檢出4種目標(biāo)化合物。

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